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《中国农业大学》 2017年
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高分辨质谱在植物代谢物分析中的应用

曹晶晶  
【摘要】:植物代谢物种类繁多、结构迥异,是植物生命活动重要的体现者。对植物代谢物进行系统深入的研究,挖掘代谢物背后蕴含的生物学意义,有利于加强对植物生命活动现象、本质与规律的理解,对增强植物对不良环境的抗性、提高作物产量与品质具有重要意义。本论文应用基于高分辨质谱的植物代谢组学技术,建立了 6种植物激素与40种游离氨基酸的检测方法;结合基因表达分析,研究了茉莉酸对拟南芥代谢组的影响;对大刍草-玉米代谢组进行了比较研究,并对玉米驯化过程中的代谢物变异进行了初步的遗传解析。植物激素检测面临着含量低、性质不稳定、基质复杂的困难,本研究应用液-液萃取与同位素稀释技术,建立了 6种植物激素的检测方法。结果表明,液-液萃取提供了较高的提取效率,同位素稀释校正了样品分析过程中的偏差,超高效液相色谱与高分辨质谱保证了方法的特异性与灵敏度。对方法的准确度、精度、灵敏度、线性和回收率进行评价,表明该方法满足实际分析的需要,同时使用该方法对拟南芥中植物激素的时间与空间分布进行了初步的分析。应用柱前衍生、反相超高效液相色谱与高分辨质谱,建立了 40种游离氨基酸的检测方法。在解决了氨基酸极性较强、缺少显色基团问题的同时,提高了分离效率与检测灵敏度。对方法的特异性、线性、灵敏度、回收率和重现性进行验证,该方法具有快速、高效和高灵敏度的优点。结合主成分分析,对多种蔬菜中的游离氨基酸含量进行了比较。结果表明,不同蔬菜中游离氨基酸的种类大致相同,但其含量存在显著差异;该方法适用于基质复杂的植物材料,也可以扩展到果汁、水果等其它相关样品的分析。对拟南芥野生型、茉莉酸合成缺失突变体opr3以及茉莉酸处理后的opr3突变体进行了代谢组分析,一共检测到超过10000个化合物离子,其中2000多个离子信号在不同的基因型或处理组间存在显著差异。统计分析结果表明拟南芥野生型与突变体opr3存在明显的代谢物差异,外源茉莉酸处理能使突变体中部分代谢物逐渐恢复到野生型的水平。本实验还建立了一个差异代谢物数据库,包含了 174个代谢物的保留时间、母离子与特征二级碎片的精确质量,以及109个代谢物的化学结构。对鉴定到的差异代谢物进行了聚类分析与通路分析,结果表明硫代葡萄糖苷与色氨酸代谢、脂类代谢、氨基酸、小肽等都受到了茉莉酸的调节。使用荧光定量反转录PCR对相关通路中的重要基因进行了表达量的检测,验证了代谢组的结果,这些结果揭示了植物激素与植物代谢物之间的相互作用与调节网络,加强了我们对茉莉酸生物功能的理解。比较了 30个大刍草和40个玉米品系的代谢组,检测了 624份玉米与大刍草重组自交系群体中的代谢物,并对挖掘到的重要代谢物进行靶标分析。结果表明玉米与大刍草代谢组存在差异,鉴定到97个玉米与大刍草间分化的代谢物。在重组自交系群体中,鉴定到了 299个有QTL定位结果的代谢物,这些代谢物种类各异,参与了多条重要的代谢通路。后续对重要差异代谢物的遗传解析,并克隆相关基因对玉米的遗传改良具有重要的指导意义。
【关键词】:植物代谢组学 植物激素 游离氨基酸 UPLC-HRMS 玉米驯化
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q945
【目录】:
  • 摘要4-5
  • Abstract5-10
  • 缩略词10-12
  • 第一章 文献综述12-30
  • 1.1 植物代谢组学研究概述12-18
  • 1.1.1 植物代谢组学研究内容12
  • 1.1.2 植物代谢组学研究方法12-17
  • 1.1.3 植物代谢组学的应用与面临的挑战17-18
  • 1.2 植物激素及其检测技术研究进展18-20
  • 1.2.1 植物激素的结构与功能18-19
  • 1.2.2 植物激素检测技术研究进展19-20
  • 1.3 植物游离氨基酸及其检测技术研究进展20-22
  • 1.3.1 植物游离氨基酸结构与功能20-21
  • 1.3.2 植物游离氨基酸检测技术研究进展21-22
  • 1.4 茉莉酸对拟南芥代谢组的影响22-26
  • 1.4.1 茉莉酸的功能22
  • 1.4.2 茉莉酸的生物合成与信号转导22-24
  • 1.4.3 茉莉酸合成过程中的关键酶OPR324-25
  • 1.4.4 茉莉酸与植物次生代谢25-26
  • 1.5 玉米驯化过程的代谢组变异与代谢组的遗传连锁分析26-28
  • 1.5.1 玉米的驯化26-27
  • 1.5.2 代谢组变异与代谢组的遗传连锁分析27-28
  • 1.6 本研究的目的与意义28-30
  • 第二章 实验材料和方法30-40
  • 2.1 实验材料30-31
  • 2.1.1 植物材料30
  • 2.1.2 仪器设备30-31
  • 2.1.3 主要试剂31
  • 2.2 试验方法31-40
  • 2.2.1 植物材料培养31
  • 2.2.2 茉莉酸甲酯处理31
  • 2.2.3 代谢物的提取31-33
  • 2.2.4 代谢物分析的仪器方法33-35
  • 2.2.5 代谢物分析的数据处理35-36
  • 2.2.6 基因表达量的检测36-38
  • 2.2.7 植物总蛋白提取与定量38-40
  • 第三章 植物激素检测方法的建立40-46
  • 3.1 检测方法的建立40-43
  • 3.1.1 前处理条件的选择40
  • 3.1.2 同位素内标的使用40-42
  • 3.1.3 仪器分析方法的优化42-43
  • 3.2 方法的验证43-44
  • 3.3 方法的应用44-45
  • 3.4 小结45-46
  • 第四章 植物游离氨基酸检测方法的建立46-56
  • 4.1 检测方法的建立46-50
  • 4.1.1 植物游离氨基酸提取方法的优化46-48
  • 4.1.2 仪器分析方法的优化48-50
  • 4.2 方法的验证50-53
  • 4.3 方法的应用53-55
  • 4.4 小结55-56
  • 第五章 使用代谢组学研究茉莉酸对拟南芥代谢组的影响56-80
  • 5.1 代谢物提取方法的优化56-58
  • 5.2 数据预处理与统计分析58-61
  • 5.3 差异代谢物的鉴定、分类与通路分析61-69
  • 5.4 重要代谢通路的分析69-76
  • 5.4.1 硫代葡萄糖苷和色氨酸代谢69-71
  • 5.4.2 脂类代谢71-74
  • 5.4.3 氨基酸及其衍生物与小肽74-76
  • 5.5 硫代葡萄糖苷、色氨酸与α-亚麻酸代谢通路重要基因的表达量分析76-79
  • 5.6 讨论79-80
  • 第六章 玉米驯化过程的代谢组分析80-90
  • 6.1 玉米与大刍草存在代谢组差异80-82
  • 6.1.1 玉米与大刍草代谢组的统计分析80-81
  • 6.1.2 玉米与大刍草差异代谢物的筛选与鉴定81-82
  • 6.2 玉米与大刍草重组自交系群体的代谢组分析82-85
  • 6.2.1 数据质量评价与统计分析82-83
  • 6.2.2 重组自交系群体代谢物的鉴定与通路分析83-85
  • 6.3 苯并噁唑嗪酮类物质的结构解析85-89
  • 6.4 讨论89-90
  • 第七章 结论90-91
  • 参考文献91-106
  • 附录106-122
  • 致谢122-123
  • 个人简历123

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