收藏本站
《中国农业大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

天津地区PRRSV类NADC30毒株的监测、分离毒株的基因组特征与致病性分析

孙英峰  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重影响生猪产业的重要病毒性疫病。近年来,我国陆续报道PRRSV类NADC30毒株的流行,给猪场PRRS防控带来新的挑战。本研究对天津地区猪场PRRSV类NADC30毒株的感染情况进行了监测,分析了分离毒株的基因组特征以及致病性,并评价了现有疫苗对分离毒株攻毒的免疫保护效力,以期了解天津地区PRRSV类NADC30毒株的流行状况,为PRRSV类NADC30的防控提供依据。基于PRRSV类NADC30毒株Nsp2基因缺失的特性,建立了区分PRRSV经典毒株、高致病性毒株(HP-PRRSV)和类NADC30毒株的RT-PCR鉴别检测方法。对2014-2016年天津地区63个猪场396份临床样本进行了检测,结果表明,PRRSV阳性检出率为26.26%(104/396),其中HP-PRRSV阳性率为69.23%(72/104),PRRSV经典毒株阳性率为4.81%(5/104),类NADC30阳性率为25.96%(27/104)。2014-2016年类NADC30毒株年度阳性率依次为6.25%、17.07%和58.06%,提示类NADC30毒株感染呈现增高趋势。对扩增的Nsp2基因的变异分析表明,NADC30阳性样品中的13份样本除具有131个特征性氨基酸缺失外,还存在2个氨基酸缺失。3份阳性样品的ORF5存在1个氨基酸缺失,类NADC30毒株的Nsp2、ORF5变异呈现多样化。结合猪场使用PRRSV疫苗免疫的调查,结果显示,免疫经典PRRSV疫苗(MLV-VR2332株、CH-1R株、R98株)和HP-PRRSV减毒活疫苗(TJm-F92株、JXA1-R株)的猪场均发生类NADC30毒株感染。采用MARC-145细胞系从PRRSV类NADC30阳性样本中分离病毒,经IFA和RT-PCR鉴定,共分离到 7 株 PRRSV,分别命名为 TJnh1401、TJnh1501、TJnh1502、TJdg1601、TJdg1602、TJbd1601和TJbd1602。结合Nsp2和ORF5序列分析结果,选取分离毒株TJnh1501进行蚀斑纯化和全基因组序列测定。结果显示,分离毒株TJnh1501在MARC-145细胞上的病毒滴度可达107.0TCID50;其全基因组序列与NADC30毒株同源性仅为86.6%,而与HP-PRRSV毒株的同源性达96.3%,且Nsp2具有NADC30毒株131个氨基酸缺失的分子特征;应用SimPlot生物学软件的分析结果表明,TJnh1501为HP-PRRSV疫苗毒株与NADC30毒株的重组病毒,重组位置位于非结构蛋白编码区(Nsp2)的1737nt-3506nt。分析了 TJnh1501对健康仔猪的致病性。结果显示,TJnh1501感染仔猪呈现体温升高、精神沉郁、呼吸困难、流鼻涕和日增重下降的临床症状;感染仔猪的肺脏水肿、实变,肺支气管周边炎性细胞浸润、支气管黏膜上皮脱落、血管内瘀血,感染组仔猪肺脏评分显著高于对照组(p0.05)。由此表明,重组病毒TJnh1501对仔猪具有一定的致病力。进一步评价了现有商品化PRRSV疫苗对分离毒株TJnh1501的免疫保护效果。结果显示,MLV Inglevac PRRS(?)和HP-PRRSV减毒活疫苗JXA1-R株免疫仔猪不能抵抗TJnh1501的攻击,表明这两种疫苗对分离毒株TJnh1501的感染不能提供有效的免疫保护。
【关键词】:猪繁殖与呼吸综合征病毒 类NADC30毒株 监测 病毒分离 基因组特征 致病性
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 摘要3-4
  • Abstract4-11
  • 缩略词表11-12
  • 第一章 引言12-18
  • 1.1 国内外研究现状12-14
  • 1.2 研究的目与意义14
  • 1.3 研究内容与技术路线14-17
  • 1.3.1 研究内容14
  • 1.3.2 技术路线14-17
  • 1.4 研究目标17-18
  • 第二章 2014-2016年天津地区PRRSV类NADC30毒株的监测18-36
  • 2.1 引言18
  • 2.2 材料与方法18-24
  • 2.2.1 材料18-22
  • 2.2.2 方法22-24
  • 2.3 结果与分析24-34
  • 2.3.1 RT-PCR鉴别检测方法的反应体系优化结果24-25
  • 2.3.2 RT-PCR鉴别检测方法的特异性试验结果25
  • 2.3.3 RT-PCR鉴别检测方法的敏感性试验结果25-26
  • 2.3.4 RT-PCR鉴别检测方法的PCR产物测序鉴定26
  • 2.3.5 区分经典、HP和类NADC30 PRRSV的RT-PCR临床样品检测结果26-28
  • 2.3.6 PRRSV类NADC30临床样本Nsp2基因序列测定和同源性分析28-30
  • 2.3.7 基于Nsp2高变区核苷酸序列遗传进化分析30-31
  • 2.3.8 PRRSV类NADC30临床样本ORF5基因序测定和同源性分析31-32
  • 2.3.9 基于ORF5核苷酸序列遗传进化分析32
  • 2.3.10 ORF5糖基化位点分析32-34
  • 2.4 讨论34-35
  • 2.5 小结35-36
  • 第三章 PRRSV类NADC30毒株分离鉴定及基因组特征分析36-54
  • 3.1 引言36-37
  • 3.2 材料与方法37-42
  • 3.2.1 材料37-38
  • 3.2.2 方法38-42
  • 3.3 结果与分析42-52
  • 3.3.1 PRRSV类NADC30毒株分离结果42
  • 3.3.2 细胞培养物间接免疫荧光检测42-43
  • 3.3.3 细胞培养物的RT-PCR检测结果43-44
  • 3.3.4 分离毒株TJnh501蚀斑纯化试验结果44
  • 3.3.5 分离毒株TJnh501在MARC-145细胞增殖规律44
  • 3.3.6 分毒毒株TJnh1501全基因组扩增44-45
  • 3.3.7 分离毒株TJnh1501基因测序与拼接45-46
  • 3.3.8 分离毒株TJnh1501全基因组序列分析46-52
  • 3.4 讨论52-53
  • 3.5 小结53-54
  • 第四章 PRRSV类NADC30重组病毒TJnh1501致病性分析54-64
  • 4.1 引言54
  • 4.2 材料与方法54-58
  • 4.2.1 材料54-55
  • 4.2.2 方法55-58
  • 4.3 结果与分析58-62
  • 4.3.1 体温动态变化58
  • 4.3.2 临床症状评分58-59
  • 4.3.3 日增重变化59-60
  • 4.3.4 血清中病毒滴度60
  • 4.3.5 血清中N蛋白抗体水平60-61
  • 4.3.6 肺脏大体病变及评分61
  • 4.3.7 肺脏显微组织病变及评分61-62
  • 4.4 讨论62-63
  • 4.5 小结63-64
  • 第五章 PRRSV疫苗对重组病毒TJnh1501的免疫保护效果分析64-74
  • 5.1 引言64
  • 5.2 材料与方法64-66
  • 5.2.1 材料64-65
  • 5.2.2 方法65-66
  • 5.3 结果与分析66-73
  • 5.3.1 体温动态变化66
  • 5.3.2 临床症状及评分66-67
  • 5.3.3 日增重分析67-68
  • 5.3.4 血清中病毒滴度68-69
  • 5.3.5 血清N蛋白抗体水平69-70
  • 5.3.6 大体剖检病变及评分70-71
  • 5.3.7 显微组织病变及评分71-73
  • 5.4 讨论73
  • 5.5 小结73-74
  • 第六章 结论74-75
  • 第七章 创新点75-76
  • 第八章 文献综述 我国PRRSV变异与毒株多样性76-82
  • 8.1 PRRSV病原学研究76
  • 8.2 我国PRRSV的变异与演化76-78
  • 8.3 PRRSV变异与演化的分子机制78-79
  • 8.4 PRRSV变异与致病性79-80
  • 8.5 展望80-82
  • 参考文献82-88
  • 致谢88-90
  • 个人简介90

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 张洪亮;张晶;李真;张文立;刘春晓;陈家锃;相丽润;冷超粮;彭金美;王倩;白云;安同庆;童光志;蔡雪辉;田志军;;2016年我国部分地区类NADC30新亚群猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析[J];中国预防兽医学报;2016年09期
2 杨汉春;周磊;;猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异与演化[J];生命科学;2016年03期
3 常晓博;赵款;叶超;姜成刚;王淑杰;蔡雪辉;张辉;安同庆;;PRRSV新亚型毒株JL580的基因组变异特征研究[J];中国兽药杂志;2015年05期
4 周峰;常洪涛;赵军;陈陆;王新卫;刘红英;姚慧霞;王川庆;杨霞;;2012―2013年猪繁殖与呼吸综合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调查[J];中国兽医学报;2014年09期
5 Wasin Charerntantanakul;;Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects[J];World Journal of Virology;2012年01期
6 杨汉春;;猪高热综合征的发生与流行概况[J];猪业科学;2007年01期
7 杨汉春,管山红,尹晓敏,甘孟侯;猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定[J];中国兽医杂志;1997年10期
8 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙;从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J];中国畜禽传染病;1996年02期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘灿;猪繁殖与呼吸综合征高致病性毒株的致弱评价与相关分子机制研究[D];中国农业大学;2015年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王治家;张婧;白伟杰;孙普;曹轶梅;李冬;刘在新;卢曾军;;通过基因组合成构建美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆[J];中国兽医科学;2017年07期
2 李冰;卢赫;;欧洲型PRRSV辽宁株LNEU12的分离及其ORF5的序列分析[J];畜牧与兽医;2017年07期
3 徐丽美;付明哲;何亚鹏;许信刚;于三科;张琪;;陕西省部分地区PRRSV流行毒株ORF3和ORF5基因的遗传变异分析[J];动物医学进展;2017年06期
4 郭振华;陈鑫鑫;郭军庆;乔松林;;猪繁殖与呼吸综合征病毒主要流行毒株检测方法的建立[J];动物医学进展;2017年06期
5 冷雪;李真光;武华;杜锐;;高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)临床免疫效果的研究[J];黑龙江畜牧兽医;2017年11期
6 李小璟;龚双燕;陈瑛琪;李雨濛;蔡瑶;徐逸飞;朱玲;徐志文;;猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用[J];中国兽医科学;2017年05期
7 施开创;许心婷;舒秀远;莫胜兰;陈汉忠;;高水平母源抗体仔猪接种猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗的免疫效果分析[J];中国预防兽医学报;2017年05期
8 李晓辉;;猪繁殖与呼吸综合症的诊断方法及防治措施[J];现代畜牧科技;2017年05期
9 李朝;;规模化养殖场猪繁殖与呼吸综合征的防治技术探讨[J];云南畜牧兽医;2017年02期
10 杨达汉;邓守全;王哲;王丰;薛江东;刘锴;霍晓伟;马德慧;;猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定[J];中国兽医学报;2017年04期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 孙英峰;天津地区PRRSV类NADC30毒株的监测、分离毒株的基因组特征与致病性分析[D];中国农业大学;2017年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 周峰;常洪涛;赵军;陈陆;王新卫;刘红英;姚慧霞;王川庆;杨霞;;2012―2013年猪繁殖与呼吸综合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调查[J];中国兽医学报;2014年09期
2 朱佳毅;任晓峰;;猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法的研究进展[J];中国预防兽医学报;2014年01期
3 冷雪;李真光;王凤雪;温永俊;夏铭崎;武华;;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NM1株全基因测序及致病性分析[J];中国兽医学报;2012年12期
4 ;Evolution of quasispecies diversity for porcine reproductive and respiratory syndrome virus under antibody selective pressure[J];Science China(Life Sciences);2012年09期
5 侯丽丽;赵铁柱;遇秀玲;曹振;邓小雨;乔明明;张硕;王斌;陈西钊;田克恭;;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查[J];中国兽医学报;2009年06期
6 韦祖樟;孙志;袁世山;;猪繁殖与呼吸综合症病毒分子生物学研究进展[J];微生物学通报;2008年03期
7 童光志;周艳君;郝晓芳;田志军;仇华吉;彭金美;安同庆;;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J];中国预防兽医学报;2007年05期
8 高志强,郭鑫,杨汉春,陈艳红,查振林;猪繁殖与呼吸综合征病毒缺失变异株的基因组特征[J];畜牧兽医学报;2005年06期
9 杨汉春,管山红,尹晓敏,甘孟侯;猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定[J];中国兽医杂志;1997年10期
10 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙;从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J];中国畜禽传染病;1996年02期
【相似文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 孙英峰;天津地区PRRSV类NADC30毒株的监测、分离毒株的基因组特征与致病性分析[D];中国农业大学;2017年
中国知网广告投放
相关机构
>中国农业大学
相关作者
>孙英峰
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026