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《河北科技大学》 2016年
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产黄青霉突变体库的构建及鉴定

韩梁彦  
【摘要】:青霉素是抗生素领域重要战略品种之一,产黄青霉(Penicillium chrysogenum)是生产青霉素的真菌,具有极其重要的工业价值。目前工业上使用的菌株是P.chrysogenumNRRL 1951经多轮诱变育种得来的,青霉素产量较原始出发菌已提高了近千倍,因此目前传统的菌种改造和发酵调控难以使P.chrysogenum的青霉素水平有较大提高。为了获得更高的产量,应用基因工程技术将P.chrysogenum改良成为适于青霉素工业生产成为目前的主要研究任务。本实验旨在应用基因工程技术改良P.chrysogenum工业菌株,以期在原有青霉素产量上有所突破,使青霉素产量提高。本实验采用工业产黄青霉(P.chrysogenum)为出发菌株,应用原生质体融合法将外源博来霉素抗性基因通过PCR合成的T-DNA介导转化产黄青霉(P.chrysogenum),通过抗生素平板筛选获得大量转化子,为筛选青霉素高产突变株奠定了基础。为确定外源基因是否导入,采用简便的高通量基因组提取方法,以酶解法为基础,结合超声处理与高温加热处理的方式,提出较高质量的基因组DNA,后进行PCR反应。结果表明应用混合酶液酶解效果最佳,其中蜗牛酶终浓度6 mg/mL纤维素酶终浓度4 000 U/mL,超声处理10-15 min,28℃酶解14 h,最后90-98℃加热10-15 min,然后加入50-100μLddH2O混匀,静置直至分层,取上清直接PCR,得到了清晰准确的条带。对所构建的P.chrysogenum突变体库筛选是通过24孔板微培养结合高通量检测技术进行的,结果表明,所鉴定的324株突变株中,青霉素含量提高的菌株12株,青霉素产量下降的菌株134株,产孢较早的9株。本研究所建立的产黄青霉高通量基因组提取创新方法,不仅能够满足产黄青霉突变株后续分子鉴定且为其他丝状真菌的基因组提取提供参考。结合高效转化体系和高通量筛选平台,可在短时间内完成多个样品的相对比较,提高了工作效率。
【学位授予单位】:河北科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q93

【参考文献】
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