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《河北科技大学》 2016年
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产黄青霉突变体库的构建及鉴定

韩梁彦  
【摘要】:青霉素是抗生素领域重要战略品种之一,产黄青霉(Penicillium chrysogenum)是生产青霉素的真菌,具有极其重要的工业价值。目前工业上使用的菌株是P.chrysogenumNRRL 1951经多轮诱变育种得来的,青霉素产量较原始出发菌已提高了近千倍,因此目前传统的菌种改造和发酵调控难以使P.chrysogenum的青霉素水平有较大提高。为了获得更高的产量,应用基因工程技术将P.chrysogenum改良成为适于青霉素工业生产成为目前的主要研究任务。本实验旨在应用基因工程技术改良P.chrysogenum工业菌株,以期在原有青霉素产量上有所突破,使青霉素产量提高。本实验采用工业产黄青霉(P.chrysogenum)为出发菌株,应用原生质体融合法将外源博来霉素抗性基因通过PCR合成的T-DNA介导转化产黄青霉(P.chrysogenum),通过抗生素平板筛选获得大量转化子,为筛选青霉素高产突变株奠定了基础。为确定外源基因是否导入,采用简便的高通量基因组提取方法,以酶解法为基础,结合超声处理与高温加热处理的方式,提出较高质量的基因组DNA,后进行PCR反应。结果表明应用混合酶液酶解效果最佳,其中蜗牛酶终浓度6 mg/mL纤维素酶终浓度4 000 U/mL,超声处理10-15 min,28℃酶解14 h,最后90-98℃加热10-15 min,然后加入50-100μLddH2O混匀,静置直至分层,取上清直接PCR,得到了清晰准确的条带。对所构建的P.chrysogenum突变体库筛选是通过24孔板微培养结合高通量检测技术进行的,结果表明,所鉴定的324株突变株中,青霉素含量提高的菌株12株,青霉素产量下降的菌株134株,产孢较早的9株。本研究所建立的产黄青霉高通量基因组提取创新方法,不仅能够满足产黄青霉突变株后续分子鉴定且为其他丝状真菌的基因组提取提供参考。结合高效转化体系和高通量筛选平台,可在短时间内完成多个样品的相对比较,提高了工作效率。
【关键词】:青霉素 产黄青霉 高通量筛选 DNA提取 原生质体 PCR 转化 T-DNA
【学位授予单位】:河北科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q93
【目录】:
  • 摘要5-6
  • Abstract6-11
  • 第1章 绪论11-17
  • 1.1 产黄青霉简介11
  • 1.2 青霉素简介11
  • 1.3 青霉素的生物合成途径11-12
  • 1.4 青霉素的生产情况12
  • 1.5 产黄青霉育种方法12-14
  • 1.5.1 自然育种13
  • 1.5.2 诱变育种13
  • 1.5.3 分子遗传育种技术方法13-14
  • 1.6 产黄青霉分子育种研究进展14-15
  • 1.7 产黄青霉基因工程研究进展15-16
  • 1.7.1 Vgb基因的研究15
  • 1.7.2 Lae A基因的研究15
  • 1.7.3 其他基因的研究15-16
  • 1.8 本文研究思路内容及意义16-17
  • 第2章 产黄青霉原生质体制备及转化17-29
  • 2.1 前言17
  • 2.2 材料与方法17-22
  • 2.2.1 菌种17
  • 2.2.2 实验试剂17-19
  • 2.2.3 实验设备19
  • 2.2.4 试剂的配置19-20
  • 2.2.5 产黄青霉的培养20
  • 2.2.6 质粒的提取及合成T-DNA20-21
  • 2.2.7 产黄青霉原生质体的制备21
  • 2.2.8 原生质体转化21
  • 2.2.9 原生质体的再生21-22
  • 2.3 结果与分析22-27
  • 2.3.1 菌丝培养时间对原生质体制备的影响22-23
  • 2.3.2 酶解时间对原生质体制备的影响23-25
  • 2.3.3 PEG8000与PEG4000对原生质体转化情况的影响25-26
  • 2.3.4 不同抗生素加入量对原生质体再生的影响26-27
  • 2.4 本章小结27-29
  • 第3章 产黄青霉突变株的PCR鉴定29-43
  • 3.1 前言29-30
  • 3.2 实验材料30-31
  • 3.2.1 实验菌种30
  • 3.2.2 实验仪器30
  • 3.2.3 实验试剂30
  • 3.2.4 实验所用培养基30-31
  • 3.3 实验方法31
  • 3.3.1 产黄青霉的固体培养31
  • 3.3.2 产黄青霉基因组的常规提取方法31
  • 3.4 简易基因组DNA提取方法的研究31-32
  • 3.4.1 菌丝的酶解31
  • 3.4.2 等渗溶液的选择31
  • 3.4.3 超声处理31
  • 3.4.4 加热处理31-32
  • 3.4.5 PCR扩增32
  • 3.5 结果与分析32-39
  • 3.5.1 所用酶种类及使用浓度对DNA提取的影响32-33
  • 3.5.2 酶解温度和酶解时间对DNA提取的影响33-35
  • 3.5.3 渗透剂的选择对DNA提取的影响35-36
  • 3.5.4 超声对DNA提取的影响36-37
  • 3.5.5 加热处理对DNA提取的影响37-39
  • 3.6 应用简便方法提取产黄青霉基因组验证转化子39-40
  • 3.7 简便基因组提取方法应用于其他真菌40
  • 3.8 本章小结40-43
  • 第4章 产黄青霉突变体库青霉素产量测定及突变株的筛选43-51
  • 4.1 前言43-44
  • 4.2 实验材料44-45
  • 4.2.1 实验试剂44-45
  • 4.2.2 实验仪器45
  • 4.3 实验方法45-46
  • 4.3.1 产黄青霉突变株的平板培养45
  • 4.3.2 产黄青霉突变株24孔板发酵培养45
  • 4.3.3 碘量法测定24孔板发酵培养青霉素含量45
  • 4.3.4 产黄青霉突变株摇瓶发酵培养45
  • 4.3.5 碘量法测定摇瓶发酵青霉素的含量45
  • 4.3.6 产黄青霉米孢子的制备45-46
  • 4.4 结果与分析46-49
  • 4.4.1 青霉素标准曲线的绘制46-47
  • 4.4.2 24 微孔高通量发酵培养47-48
  • 4.4.3 产黄青霉摇瓶发酵48-49
  • 4.5 本章小结49-51
  • 结论51-53
  • 参考文献53-57
  • 攻读硕士学位期间所发表的论文及成果57-59
  • 致谢59

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