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《河北科技大学》 2016年
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多粘类芽孢杆菌在茶叶上的定殖及其对叶际细菌群落的影响

岑浴  
【摘要】:多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)作为植物促生菌,具有微生物农药和微生物菌肥的双重作用,将其制备成微生物肥料作用于根际已广泛研究,而且得到良好的效益,然而其作为植物促生菌在叶际上的研究则较少。植物叶际是植物、微生物与环境相互作用的活跃界面,植物为微生物提供附着位点和营养物质,微生物则通过复杂的作用对植物产生有益或有害的影响。定殖是叶际微生物发挥作用的先决条件。本文设计了大田试验,将甘薯废水资源化利用制备多粘类芽孢杆菌菌剂并探究菌剂在茶树叶际上的定殖及其对叶际微生物的影响。本课题以定性和定量分析相结合,采用了实时荧光定量PCR技术研究了多粘类芽孢杆菌在茶树叶际的定殖情况,及其对叶际总细菌、总真菌及部分病原菌的影响,采用高通量测序技术分析了施用菌剂对叶际细菌群落的影响。获得主要结果如下:1)利用甘薯废水培养的多粘类芽孢杆菌施用在茶树上,多粘类芽孢杆菌能够在茶树叶际定殖,且不同季节其定殖情况不同。春季多粘类芽孢杆菌定殖周期为21天,即21天后处理组与对照组数量无显著性差别(P0.05);秋季多粘类芽孢杆菌的定殖周期至少为89天,即在89天后处理组数量依旧高于对照组。2)对几种人体细菌性病原菌进行实时荧光定量PCR分析,结果显示多粘类芽孢杆菌对常见的细菌性病原菌如铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)和分枝杆菌(Mycobacterium spp.)影响不显著(P0.05)。3)通过对春季和秋季部分茶叶样品进行16S rRNA基因高通量测序,结果显示茶树叶际细菌优势类群为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)。不同季节其优势菌属有所差异,春季样品中unclassified菌群占优势,紧随其后的是甲基杆菌属(Methylobacterium)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas);秋季样品中甲基杆菌属(Methylobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Aureimonas和泛菌属(Pantoea)占主要地位。4)多粘类芽孢杆菌的施用第一天后能够引起部分菌群数量的增加,如厚壁菌门(Firmicutes)和绿弯菌门(Chloroflexi),但这种增加在施菌后第三天就降至对照水平。5)茶叶样品叶际细菌群落α-多样性和β-多样性的结果表明,季节性的变化对茶树叶际细菌群落结构的影响更为显著;春季茶树叶际细菌多样性高于秋季。
【关键词】:多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) 茶树 叶际微生物 定殖 实时荧光定量PCR 16S rRNA基因高通量测序
【学位授予单位】:河北科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S571.1;S182
【目录】:
  • 摘要4-5
  • Abstract5-10
  • 第1章 绪论10-18
  • 1.1 叶际微生物研究进展10-12
  • 1.1.1 叶际微生物的定殖10-11
  • 1.1.2 叶际微生物的群落结构多样性11-12
  • 1.1.3 叶际微生物的功能多样性12
  • 1.2 多粘类芽孢杆菌研究进展12-14
  • 1.2.1 多粘类芽孢杆菌的生理特性12-13
  • 1.2.2 多粘类芽孢杆菌的生态功能13-14
  • 1.3 微生物定殖及多样性研究方法14-16
  • 1.3.1 BIOLOG技术14
  • 1.3.2 脂质分析技术14
  • 1.3.3 荧光原位杂交(FISH)技术14-15
  • 1.3.4 基于PCR的研究技术15
  • 1.3.5 高通量测序技术15-16
  • 1.4 本课题的研究意义、内容和技术路线16-18
  • 1.4.1 研究意义和内容16-17
  • 1.4.2 研究技术路线17-18
  • 第2章 P.polymyxa菌剂在茶树叶际定殖能力的研究18-36
  • 2.1 仪器与试剂18-22
  • 2.1.1 实验仪器18-19
  • 2.1.2 主要试剂19-21
  • 2.1.3 主要溶液的配制21-22
  • 2.2 材料与方法22-25
  • 2.2.1 P.polymyxa菌剂的制备22
  • 2.2.2 P.polymyxa菌剂的喷施22-23
  • 2.2.3 茶叶样品采集及DNA提取23
  • 2.2.4 质粒制备及提取23-24
  • 2.2.5 定量PCR体系的建立24-25
  • 2.3 结果25-34
  • 2.3.1 采样周期内温度及降雨量变化25-26
  • 2.3.2 质粒常规PCR检验26-27
  • 2.3.3 定量PCR标准曲线及溶解曲线27-30
  • 2.3.4 春季P.polymyxa定殖规律及对叶际微生物的影响30-32
  • 2.3.5 秋季P.polymyxa定殖规律及对叶际微生物的影响32-34
  • 2.4 讨论34-35
  • 2.4.1 P.polymyxa在茶树叶际的定殖规律34-35
  • 2.4.2 P.polymyxa对茶树叶际微生物数量的影响35
  • 2.5 本章小结35-36
  • 第3章 P.polymyxa菌剂对茶树叶际病原菌的影响36-46
  • 3.1 仪器与试剂37
  • 3.1.1 实验仪器37
  • 3.1.2 主要试剂37
  • 3.1.3 主要溶液的配制37
  • 3.2 材料与方法37-39
  • 3.2.1 茶叶样品采集及DNA提取37-38
  • 3.2.2 病原菌常规PCR定性检测38
  • 3.2.3 病原菌定量PCR检测38-39
  • 3.3 结果与讨论39-44
  • 3.3.1 病原菌定性检测39-40
  • 3.3.2 定量PCR标准曲线及溶解曲线40-42
  • 3.3.3 病原菌定量检测42-44
  • 3.4 本章小结44-46
  • 第4章 P.polymyxa菌剂对茶树叶际细菌群落的影响46-60
  • 4.1 仪器与试剂47
  • 4.1.1 实验仪器47
  • 4.1.2 主要试剂47
  • 4.2 材料与方法47-50
  • 4.2.1 茶叶样品准备47
  • 4.2.2 细菌16S rRNA基因V3~V4区PCR扩增并测序47-49
  • 4.2.3 数据处理与质控49
  • 4.2.4 去除嵌合体及靶区域外序列49
  • 4.2.5 OTUs聚类及赋予物种分类单元49
  • 4.2.6 Alpha多样性分析49-50
  • 4.2.7 Beta多样性分析50
  • 4.3 结果与讨论50-58
  • 4.3.1 细菌16S rRNA基因V3~V4区PCR扩增50
  • 4.3.2 稀释曲线50-51
  • 4.3.3 Shannon指数51-52
  • 4.3.4 Bray-Cutis矩阵分析52-53
  • 4.3.5 PCoA分析53-54
  • 4.3.6 细菌群落结构分析54-58
  • 4.4 本章小结58-60
  • 结论60-62
  • 参考文献62-70
  • 攻读硕士学位期间所发表的论文70-72
  • 致谢72

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