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《河北科技大学》 2016年
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农杆菌介导抗虫基因PPA的旱稻转化

张冠华  
【摘要】:由于水资源短缺,导致水稻的生产受到限制,旱稻作为一个需水量少耐干旱的品种,具有良好的发展及应用前景。由于虫害是导致水稻减产的一个重要因素,利用转基因培育具有抗虫性的旱稻品种,具有经济效益和生态效益。PPA基因具有杀虫的生理活性,在抗虫转基因作物育种方面应用前景广阔。本研究选用“旱稻2号”作为实验材料,以Bar基因作为筛选标记基因,通过农杆菌介导法将抗虫基因PPA导入旱稻的基因组中,对转化体系进行中的各种因素进行了优化,培育出了有抗除草剂、抗虫活性的转基因旱稻植株。通过PCR对转化旱稻植株进行了鉴定,PCR结果证明PPA基因已经成功整合到旱稻2号基因组中。大田喷洒0.5 mg/mL的草铵膦,筛选得到有除草剂抗性的T_1代植株。在实验室对T_2代转化株系进行纯合体筛选,对全部携带除草剂抗性的株系进行PCR鉴定,筛选纯合株系。本实验利用地高辛标记的Southern杂交技术对筛选得到的转PPA的旱稻2号株系进行检测。Southern杂交有许多影响因素,例如:酶切体系、样品DNA的量、探针浓度、杂交条件等。实验结果表明:在60μL的酶切体系中适宜加入15μg的DNA,90U的内切酶,酶切15-16 h。在杂交体系中5 mL杂交液中适宜加入的探针的量为150 ng。Southern杂交结果表明:PPA基因以多拷贝的形式整合到旱稻2号基因组中。
【关键词】:旱稻 农杆菌介导法 除草剂 PCR Southern杂交
【学位授予单位】:河北科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S511.6;Q943.2
【目录】:
  • 摘要4-5
  • Abstract5-10
  • 第1章 绪论10-16
  • 1.1 植物转基因技术10-11
  • 1.1.1 植物转基因技术在农业上的应用及发展10
  • 1.1.2 水稻转基因技术10-11
  • 1.2 抗虫转基因旱稻的培育11-12
  • 1.3 植物凝集素12-13
  • 1.3.1 植物凝集素的性质及功能12
  • 1.3.2 植物凝集素的抗虫研究12-13
  • 1.4 有抗虫效果的植物凝集素13-14
  • 1.4.1 雪花莲凝集素(GNA)13
  • 1.4.2 半夏凝集素基因13-14
  • 1.5 课题来源14
  • 1.6 研究内容和目的14-16
  • 1.6.1 研究内容14-15
  • 1.6.2 研究目的15-16
  • 第2章 转基因旱稻植株的获得16-30
  • 2.1 概述16
  • 2.2 实验材料、试剂及设备16-19
  • 2.2.1 实验材料16-17
  • 2.2.2 实验试剂17-19
  • 2.2.3 实验设备与仪器19
  • 2.3 实验方法19-23
  • 2.3.1 母液的配制19-21
  • 2.3.2 培养基的配制21-22
  • 2.3.3 愈伤组织的诱导及继代22
  • 2.3.4 农杆菌的制备22
  • 2.3.5 农杆菌介导的转化22-23
  • 2.3.6 愈伤组织的脱菌、筛选及分化成苗23
  • 2.3.7 2, 4-D对愈伤组织的诱导率的影响23
  • 2.3.8 数据统计23
  • 2.4 实验结果23-27
  • 2.4.1 愈伤组织的诱导23-24
  • 2.4.2 农杆菌介导转化体系的优化24-27
  • 2.4.3 数据统计结果27
  • 2.5 讨论27-28
  • 2.6 本章小结28-30
  • 第3章 转基因旱稻的PCR检测30-36
  • 3.1 概述30
  • 3.2 实验材料、试剂及仪器30-31
  • 3.2.1 实验材料30
  • 3.2.2 实验试剂30-31
  • 3.2.3 主要仪器31
  • 3.3 实验方法31-34
  • 3.3.1 主要溶液配制31-32
  • 3.3.2 旱稻DNA的提取32-33
  • 3.3.3 PCR筛选阳性转基因植株33-34
  • 3.4 实验结果34-35
  • 3.4.1 提取DNA的质量检测34
  • 3.4.2 目的基因PCR反应结果34
  • 3.4.3 测序结果34-35
  • 3.5 讨论35
  • 3.6 本章小结35-36
  • 第4章 转基因旱稻的纯合体筛选36-42
  • 4.1 概述36
  • 4.2 实验材料、试剂及仪器36-37
  • 4.2.1 实验材料36
  • 4.2.2 实验试剂36
  • 4.2.3 实验设备36-37
  • 4.3 实验方法37-38
  • 4.3.1 大田除草剂筛选37
  • 4.3.2 水稻培养液的配置37
  • 4.3.3 种子的消毒与培养37-38
  • 4.3.4 除草剂筛选38
  • 4.3.5 T_2代植株DNA的提取38
  • 4.3.6 纯合体转基因植株的PCR鉴定38
  • 4.4 实验结果38-40
  • 4.4.1 田间喷洒除草剂实验38-39
  • 4.4.2 实验室除草剂筛选结果39-40
  • 4.4.3 PCR鉴定纯合40
  • 4.5 讨论40-41
  • 4.6 本章小结41-42
  • 第5章 Southern杂交分析42-54
  • 5.1 概述42
  • 5.2 实验材料、试剂及仪器42-44
  • 5.2.1 实验材料42
  • 5.2.2 主要实验试剂42-43
  • 5.2.3 实验仪器43
  • 5.2.4 溶液的制备43-44
  • 5.3 实验方法44-48
  • 5.3.1 DNA的提取及去RNA操作44-45
  • 5.3.2 模板DNA的纯化回收45
  • 5.3.3 探针的制备45-46
  • 5.3.4 探针标记效率检测46-47
  • 5.3.5 酶切反应47
  • 5.3.6 转膜47
  • 5.3.7 杂交47-48
  • 5.3.8 洗膜48
  • 5.4 实验结果48-52
  • 5.4.1 样品DNA浓度测定48-49
  • 5.4.2 探针模板的纯化及探针标记效率检测49
  • 5.4.3 酶切体系的建立49-50
  • 5.4.4 转膜的影响因素50-51
  • 5.4.5 加入探针的量对杂交结果的影响51-52
  • 5.4.6 旱稻目的基因的Southern检测52
  • 5.5 讨论52-53
  • 5.6 本章小结53-54
  • 结论54-56
  • 参考文献56-60
  • 攻读硕士期间所发表的论文60-62
  • 致谢62

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1 张冠华;农杆菌介导抗虫基因PPA的旱稻转化[D];河北科技大学;2016年
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