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《内蒙古大学》 2017年
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拟南芥EDR2定位、Ca结合特性和在Ca依赖性生长中的生理功能研究

王妍  
【摘要】:钙是植物生长发育必需矿质元素之一。目前Ca相关植物生物学研究主要集中在两个方面:植物细胞吸收和储存Ca~(2+)的分子机制;细胞质Ca~(2+)作为第二信使介导植物内源和环境信号转导的分子机理。但是Ca~(2+)直接调节植物生长发育的分子机理尚未深入研究。拟南芥EDR2(ENHANCED DISEASE RESISTANCE2)蛋白含有三个预测结构域:PH(Pleckstrin Homology)、START(STAR Transfer)和 DUF1336(Domain of Unknown Function 1336)。已有研究证明缺失AtEDR2的拟南芥突变体atedr2的叶片通过水杨酸途径表现抗白粉菌的表型。但是有关AtEDR2蛋白确切的亚细胞定位和在植物Ca~(2+)依赖性生长方面的功能尚未有报道。本论文在这些方面的主要实验结果如下:(1)AtEDR2启动子活性主要集中在叶、根、花序和角果柄组织。在叶片表面的表皮毛中也有强活性,但缺失AtEDR2基因对拟南芥叶表面表皮毛的密度和性状没有明显影响。通过构建编码AtEDR2全长和不同结构域同绿色荧光蛋白GFP的融合基因,在烟草瞬时表达以后发现,AtEDR2定位在内质网,可以同内质网标记蛋白ER::mCherry共定位。同时AtEDR2的PH结构域是AtEDR2在内质网定位必需结构域。(2)通过对比拟南芥野生型Col和atedr2突变体在含有不同浓度和种类的矿质元素培养基上的生长,我们发现atedr2只有在Ca~(2+)养分缺乏的培养基上表现叶和根生长被显著抑制的表型,证明AtEDR2特异性调节拟南芥Ca~(2+)依赖性根和叶的生长。无论生长在全营养还是Ca~(2+)缺乏培养基上,拟南芥Col和atedr2的根和叶的总钙以及水溶性钙含量没有显著差异。这说明atedr2低Ca~(2+)敏感的生长表型不是因为其吸收或是积累Ca~(2+)能力降低而导致的。我们在体外表达纯化了带有GST(Glutathione-S-Transferase)标签的AtEDR2结构域片段,利用MicroCal iTC200微量热等温滴定量热仪,证明AtEDR2的PH结构域具有Ca~(2+)结合特性。有研究证明AtEDR2的PH结构域可以结合磷脂酰肌醇-4-磷酸PI4P,本研究的组织免疫荧光实验证明AtEDR2不参与PI4P的分布,很有可能是通过PH结构域的Ca结合特性调节Ca依赖生长。(3)基于蛋白组学数据,我们对在Col和atedr2之间、丰度显著变化蛋白对应的基因突变体进行纯合鉴定,进一步进行Ca依赖的生长表型分析,发现只有atstt3b基因缺失突变体同atedr2一样,表现低Ca敏感表型。AtSTT3B基因被预测编码位于内质网的低聚糖糖基转移酶,负责内质网内原生蛋白最初的糖基加载过程。尽管低Ca处理确实可以显著提高总蛋白N-糖基化水平,但是,无论是生长在全营养还是Ca~(2+)缺乏培养基上,拟南芥Col和atedr2突变体之间,总蛋白N-糖基化程度没有区别。证明AtEDR2不参与低钙胁迫对蛋白N-糖基化的调节。(4)基于芯片的表达谱分析发现,低Ca处理诱导大量和过氧化物以及水杨酸积累相关基因的表达。组织化学染色也证明在低Ca的情况下,atedr2突变体的叶片比野生型Col积累更多的过氧化氢。同时这些基因的转录水平在atedr2突变体内升高的倍数显著高于野生型Col,证明AtEDR2负调控低Ca诱导的基因转录反应。在atedr2-6/ein2-1双突变体中,阻断atedr2-6突变体内乙烯信号转导途径对atedr2-6在低Ca条件下生长受抑制的表型没有影响。但是阻断水杨酸的合成可以部分恢复atedr2-6在低Ca条件下生长受抑制的表型。这表明水杨酸合成途径部分参与了 AtEDR2介导的Ca依赖性生长过程。
【关键词】:拟南芥 AtEDR2 Ca PH结构域 内质网
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q945
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-12
  • 缩略词表12-15
  • 第一章 文献综述15-26
  • 1.1 钙对植物生长的重要性15-16
  • 1.1.1 钙的生理功能15
  • 1.1.2 植物对钙的吸收15-16
  • 1.1.3 土壤的缺钙现象16
  • 1.2 植物Ca~(2+)信号16-22
  • 1.2.1 Ca~(2+)信号的产生17-20
  • 1.2.2 Ca~(2+)信号的传递20-21
  • 1.2.3 细胞器内的Ca~(2+)含量21-22
  • 1.3 AtEDR2研究进展22-25
  • 1.3.1 AtEDR2结构23
  • 1.3.2 AtEDR2在植物体中的表达23-24
  • 1.3.3 AtEDR2的功能24-25
  • 1.4 本研究的意义25-26
  • 第二章 内质网Ca结合蛋白AtEDR2参与植物Ca依赖性生长过程26-66
  • 2.1 实验材料26-28
  • 2.1.1 实验植物26
  • 2.1.2 实验菌种与质粒26-27
  • 2.1.3 实验试剂27
  • 2.1.4 引物列表27-28
  • 2.2 实验仪器28
  • 2.3 实验方法28-46
  • 2.3.1 拟南芥与烟草的种植与生长28-30
  • 2.3.2 AtEDR2 T-DNA插入突变纯合体的鉴定30-31
  • 2.3.3 atedr2的表型分析31-32
  • 2.3.4 pORE O4-AtEDR2 Promoter-CDS载体构建32-36
  • 2.3.5 农杆菌侵染法36-37
  • 2.3.6 转基因阳性植株的筛选37
  • 2.3.7 AtEDR2基因的功能互补验证37-38
  • 2.3.8 AtEDR2 T-DNA插入突变体的钙含量测定38-39
  • 2.3.9 pORE R1-AtEDR2 Promoter-GUS载体构建39
  • 2.3.10 GUS组织化学染色法39-40
  • 2.3.11 35S-AtEDR2-GFP载体构建40-41
  • 2.3.12 烟草的瞬时转化41
  • 2.3.13 免疫荧光41-42
  • 2.3.14 AtEDR2蛋白的提取及Ca结合能力测定42-46
  • 2.4 实验结果与分析46-63
  • 2.4.1 AtEDR2是拟南芥Ca~(2+)依赖生长必需基因46-52
  • 2.4.2 AtEDR2不参与拟南芥Ca的积累52-53
  • 2.4.3 AtEDR2启动子活性的组织特异性研究53-57
  • 2.4.4 AtEDR2蛋白定位于内质网57-59
  • 2.4.5 AtEDR2不参与调节与全营养和低Ca培养条件下PI4P在根中的分布59-61
  • 2.4.6 AtEDR2的PH结构域具有Ca~(2+)结合特性61-63
  • 2.5 讨论63-66
  • 第三章 AtEDR2蛋白组学分析66-85
  • 3.1 实验材料66-68
  • 3.1.1 实验植物66
  • 3.1.2 实验试剂66
  • 3.1.3 引物列表66-68
  • 3.2 实验仪器68
  • 3.3 实验方法68-71
  • 3.3.1 蛋白组学材料制备68
  • 3.3.2 iTRAQ法鉴定蛋白差异表达68-69
  • 3.3.3 蛋白组学数据分析69
  • 3.3.4 相关基因突变体的表型分析69-70
  • 3.3.5 蛋白N-糖基化检测70-71
  • 3.4 实验结果与分析71-84
  • 3.4.1 拟南芥atedr2突变体蛋白组学分析71-79
  • 3.4.2 相关突变体的Ca依赖生长表型分析79-82
  • 3.4.3 AtEDR2不参与低Ca胁迫对蛋白N-糖基化的调节82-84
  • 3.5 讨论84-85
  • 第四章 AtEDR2表达谱芯片数据分析85-96
  • 4.1 实验材料85-86
  • 4.1.1 实验植物85
  • 4.1.2 实验试剂85
  • 4.1.3 引物列表85-86
  • 4.2 实验方法86-88
  • 4.2.1 表达谱芯片材料制备86
  • 4.2.2 AtEDR2表达谱芯片数据分析86
  • 4.2.3 基于芯片数据的qRT-PCR86-87
  • 4.2.4 活性氧簇检测87-88
  • 4.2.5 相关突变体的表型分析88
  • 4.3 实验结果与分析88-94
  • 4.3.1 AtEDR2负调控拟南芥对低Ca胁迫的转录反应88-92
  • 4.3.2 过氧化物和水杨酸积累途径参与了AtEDR2调节的植物Ca依赖性生长过程92-94
  • 4.4 讨论94-96
  • 参考文献96-107
  • 致谢107-108
  • 攻读学位期间发表的学术论文目录108

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 Kentaro Ifuku;Seiko Ishihara;Fumihiko Sato;;Molecular Functions of Oxygen-Evolving Complex Family Proteins in Photosynthetic Electron Flow[J];Journal of Integrative Plant Biology;2010年08期
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【共引文献】
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1 马春丽;和硕特麦丽斯;祁智;王静;张俊霞;;镁转运体MGT7参与拟南芥对高钙环境的适应[J];植物学报;2016年04期
2 梁艳丽;赵婧;刘林;杨静;李成云;;植物细胞壁在植物与病原菌互作中的作用[J];分子植物育种;2016年05期
3 Marjaana Suorsa;Fabio Rossi;Luca Tadini;Mathias Labs;Monica Colombo;Peter Jahns;Martin M.Kater;Dario Leister;Giovanni Finazzi;Eva-Mari Aro;Roberto Barbato;Paolo Pesaresi;;PGR5-PGRL1-Dependent Cyclic Electron Transport Modulates Linear Electron Transport Rate in Arabidopsis thaliana[J];Molecular Plant;2016年02期
4 赵艳玲;张长波;刘仲齐;;植物根系细胞抑制镉转运过程的研究进展[J];农业资源与环境学报;2016年03期
5 孙勇;王丹;仝征;杨倩;常丽丽;王力敏;何丽平;王旭初;;香蕉幼苗叶片响应低温胁迫的比较蛋白质组学研究[J];中国农学通报;2015年34期
6 Junyi Chen;Caroline Gutjahr;Andrea Bleckmann;Thomas Dresselhaus;;Calcium Signaling during Reproduction and Biotrophic Fungal Interactions in Plants[J];Molecular Plant;2015年04期
7 唐宽强;刘守伟;吴凤芝;赵权;;外源喷施CaCl_2对低温逆境下番茄抗冷性及开花结果的影响[J];北方园艺;2013年11期
8 李成忠;陶俊;孙燕;孔芬;耿庆萍;杜蓓;;喷钙对芍药花茎品质及叶片光合特性的影响[J];生态学杂志;2012年11期
9 Joshua Fenn;;60 Years of Development of the Journal of Integrative Plant Biology[J];Journal of Integrative Plant Biology;2012年10期
10 Peter K.Hepler;Caleb M.Rounds;Lawrence J.Winship;;Control of Cell Wall Extensibility during Pollen Tube Growth[J];Molecular Plant;2013年04期
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