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《吉林大学》 2017年
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CBFβ对Vif功能的调控以及进化压力下Vif功能的选择性研究

芮亚娟  
【摘要】:病毒感染性因子Vif(Viral infectivity factor)是HIV-1(Human immunodeficiency virus type 1)病毒的辅助蛋白之一,也是最早被发现具有拮抗宿主防御机制的HIV-1病毒功能性蛋白。并且在HIV-1的辅助蛋白中其拮抗宿主对病毒的防御机制也最先被揭示。Vif能够与宿主内的细胞因子Cul5,Elo B,Elo C,Rbx组装成Cullin-Ring E3泛素复合物,结合并诱导APOBEC3G、APOBEC3F等APOBEC3家族的蛋白泛素化降解。这一功能也完美的解释了在一些细胞系中,Vif能够促进HIV-1病毒的感染性的原因。随着CBFβ(core binding factorβ)作为Vif-Cullin-Ring E3复合物重要的辅助因子这一重要理论的提出,人们对该复合物的组装过程有了更加深入的了解。在CBFβ缺失的情况下,Vif只能够和Elo C/Elo B结合,不能够与Cul5结合,从而使E3复合物的组装有缺陷,不具有降解APOBEC3家族的蛋白的功能。即CBFβ能促进HIV-1 Vif蛋白降解靶蛋白。除此之外,研究还发现CBFβ也能够在原核细胞大肠杆菌E.coli中稳定Vif蛋白,提高Vif蛋白的可溶性,从而得到Vif蛋白的晶体结构。在天然情况下,CBFβ是调控宿主转录的关键性因子,它与RUNX(CBFα)结合,增强RUNX与DNA的亲和性,特别针对于细胞内一些关键的启动子和增强子,如巨噬细胞集落刺激因子MCSFR(macrophage colony-stimulating factor receptor)。CBFβ/RUNX形成异源二聚体能够影响人源细胞中很多基因的转录水平,从而调控细胞的分化和增殖。此外,Vif诱导细胞G2/M期阻滞以及Vif降解APOBEC3其他成员的选择性也成为了领域的研究热点。本论文围绕Vif、CBFβ、RUNX、APOBEC3H(A3H)之间相互联系进行了细致的研究和讨论,其中包括三个部分:我们在第一部分对于CBFβ参与Vif或RUNX功能的关键功能区域进行了细致的研究。通过检测CBFβ的N端和C端截短突变体,我们证明CBFβ15-126是帮助Vif降解A3G的最短功能区。CBFβLoop3的突变体对于RUNX1c介导的基因转录没有影响,但是Loop3前6个氨基酸的点突变抑制Vif对于A3G的降解。综上所述,CBFβLoop3是帮助Vif功能的重要区域,同时其突变不影响CBFβ在细胞内的正常功能。综上,Loop3可以作为设计抗HIV-1病毒药物的理想作用靶点。Vif与APOBEC3F/G之间的相互作用已经被广泛并且全面的研究,而关于Vif-A3H的结合相关信息鲜有报道。APOBEC3H在人类的细胞中有很多亚型,其中一些亚型,例如hap II,能够抑制HIV-1病毒的复制。在第二部分中,我们证明了不同于APOBEC3G/F,只有一些HIV-1亚型的Vif蛋白能够诱导A3H hap II的泛素化降解。位于HIV-1 Vif 39和49位的氨基酸,突变之后能够显著的降低Vif对A3H hap II降解的能力,但是依旧维持降解APOBEC3F/G的功能。这表明Vif与A3H hap II结合/降解的区域不同于Vif结构中A3F/G的功能区。Vif蛋白除了能够降解APOBEC3家族蛋白外,还有另外一个重要的功能,即作为细胞周期调控因子,诱导宿主细胞G2/M期阻滞。而这一功能经我们实验证明也需要CBFβ以及Vif组装的E3复合物。有趣的是,与Vif对于A3H hap II降解功能相似,只有部分Vif蛋白具有能够诱导细胞周期G2/M阻滞的能力。比如HIV-1 HXB2亚型的Vif蛋白不能够诱导细胞G2/M期阻滞,而HIV-1 NL4-3亚型的Vif蛋白则具有这个功能。在第三部分中,我们通过比较HXB2与NL4-3 Vif蛋白的氨基酸序列,发现位于31,33,36,47和50位氨基酸对于Vif诱导细胞G2/M期阻滞很重要,如果将HXB2 Vif上这5个位点的氨基酸突变成NL4-3 Vif位置上相对应的氨基酸,则赋予了其诱导细胞周期G2/M阻滞的能力。实验进一步证明,Vif蛋白对于A3H hap II降解或者诱导细胞G2//M期阻滞这两个显著的功能是具有选择性的,不能共存。而这一选择性也表明Vif蛋白仍具有一些潜在的新的机制还有待进一步挖掘。综上所述,本文对CBFβ蛋白结构上关键氨基酸进行扫描,通过功能实验发现了CBFβ影响Vif降解A3G或者参与RUNX功能的重要功能区;同时进一步探讨了CBFβ影响Vif调控细胞周期的分子机制;最后证明Vif在一定筛选压力下,通过选择性的拮抗A3H抗病毒因子或者诱导细胞G2/M期阻滞来增强病毒的生存能力。进一步完善了对于Vif蛋白本身的功能和行使功能的分子机制的研究。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373

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