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《吉林大学》 2017年
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不同种属慢病毒Vif蛋白影响HIV-1增殖和Vif蛋白与HIV-1 Gag蛋白相互作用分子机制的研究

郑雯雯  
【摘要】:病毒感染性因子(Viral infectivity factor,Vif),作为一种慢病毒辅助因子,在不同种属慢病毒中是一类保守的蛋白。研究表明,Vif蛋白通过抵抗宿主限制因子人载脂蛋白B m RNA编辑催化多肽(Apolipoprotein B m RNA-editing catalytic polypeptide-like protein,APOBEC)家族来协助病毒在非允许性细胞中的复制。宿主的APOBEC蛋白家族是一类活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶,可以介导病毒基因组发生致死性突变,具有极为有效的抗病毒功能;而Vif蛋白可以在宿主细胞内利用宿主的泛素蛋白酶复合体诱导APOBEC家族蛋白的泛素化降解,抵抗宿主对病毒的防御。由于不同种属宿主具有不尽相同的APOBEC家族蛋白,对病毒造成的生存选择压力不同,这些慢病毒的Vif蛋白也进化出了不同的策略来克服宿主的限制,因此,长期的进化使得不同种属病毒的Vif蛋白的功能存在相互隔离:虽然都是Vif拮抗APOBEC蛋白,但是牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus,BIV)的Vif不能抵抗人和猴的APOBEC蛋白,而人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)和猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)的Vif也不能够拮抗牛的APOBEC家族蛋白。虽然如此,不同种属的慢病毒Vif蛋白在进化过程中是否也保留了某些共性?既往研究中还未见报道。本研究采用细胞生物学、分子生物学、生物化学和病毒学等相关技术,首次发现:即使在没有抗病毒因子APOBEC蛋白存在的情况下,BIV Vif可以显著地抑制HIV-1的产生、感染性和增殖。这一发现具有重要的意义:一个来源于不同种属慢病毒的辅助因子可以抵抗HIV-1,并且这种来源不同的辅助因子BIV Vif与HIV-1 Vif在功能上并没有关联性,是相互独立的,这无疑为抗HIV-1提供了新的思路。一方面,BIV Vif本身可能成为一种潜在的抗病毒因子;另一方面,BIV Vif又是如何抵抗HIV-1的?深入研究其抗病毒作用机制也将为宿主抵抗病毒的研究提供更多线索。于是我们进一步的对其中的分子机制进行了探究,对于受到抑制的病毒进行了详细的分析,研究结果表明:首先,BIV Vif能够在一定程度上抑制病毒的产量;但是通过对病毒产量和病毒感染能力的详细分析,这并不是BIV Vif抵抗HIV-1的最主要原因;第二,更重要的是,BIV Vif还能够直接抑制新产生病毒的感染性;第三,更加深入的研究发现,BIV Vif可以抑制出芽病毒中组织特异性抗原(或称衣壳前体蛋白,Group specific antigen,Gag/Pr55Gag)的剪切,从而干扰了病毒复制周期中至关重要的一个环节——病毒的成熟。病毒成熟的核心过程即为出芽病毒中的Pr55Gag按照严格顺序和位点被病毒蛋白酶剪切为组成病毒颗粒的各个层面的衣壳蛋白,包括:基质(Matrix,MA/p17)、衣壳(Capsid,CA/p24)、核衣壳(Nucleocapsid,NC/p7)和p6,另外还有两个位于CA和NC、NC和p6中间的间隔肽1(Spacer peptide,SP1/p2)和间隔肽2(Spacer peptide,SP2/p1)。如上各个部分不仅对于病毒的结构组成缺一不可,并且需要按照严格顺序进行剪切产生。而BIV Vif可以抑制Pr55Gag剪切的第一步,NC/p2间的剪切。因此,BIV Vif能够显著地抑制HIV-1的感染性。这一部分研究初步阐明了BIV Vif抑制HIV-1的内在原因。接下来,一个重要的问题是为什么只有BIV Vif可以抑制HIV-1,而HIV-1或是SIV的Vif不能?根据我们的研究结果显示:相比于等量表达的HIV-1 Vif或是SIV Vif,BIV Vif能够更强地结合Pr55Gag。同时,不能结合Pr55Gag的BIV Vif突变体失去了抑制HIV-1的能力。这就解释了虽然HIV-1、SIV、BIV Vif都可以与HIV-1 Pr55Gag相互作用,但是因为BIV Vif与Pr55Gag的结合能力最强,所以BIV Vif可以显著地抑制HIV-1,而HIV-1或是SIV的Vif因与Pr55Gag的结合能力弱而不能抑制HIV-1。这部分研究进一步阐明了BIV Vif抑制HIV-1的分子机制。同时,不同种属的慢病毒Vif蛋白,包括HIV-1、SIV、BIV Vif都保留了与HIV-1 Pr55Gag相互作用的能力。而这种结合的保守性提示了对于病毒来说Vif与Pr55Gag的结合非常重要,可能对病毒的复制周期具有重要功能。Vif与HIV-1 Pr55Gag的相互作用无疑是BIV Vif拮抗病毒的核心环节,并且,这个结合在不同种属Vif间的保守性也暗示了其对病毒可能具有重要功能。因此,接下来我们利用分子克隆技术结合免疫共沉淀技术探索了二者结合的结合决定域;实验结果表明:对于HIV-1的Pr55Gag来说,Pr55Gag中对于病毒组装和成熟起重要作用的CA碳末端和p2区域对Pr55Gag与Vif的结合必不可少;对于HIV Vif和BIV Vif,它们的氮末端,尤其是第30位酪氨酸(Tyrosine,Y)和第33位精氨酸(Arginine,R)或者组氨酸(Histidine,H),对于Vif-Pr55Gag相互结合作用至关重要。Vif与HIV-1 Pr55Gag相互作用的保守决定域的鉴定对于后续BIV Vif拮抗病毒的应用研究以及后续研究Vif与HIV-1 Pr55Gag相互作用的生物学功能具有重要的意义。BIV Vif在上述人胚肾细胞系HEK 293T体系中,有效地抵抗了HIV-1的复制和增殖。那么更重要的是,这种抗病毒作用在HIV的靶细胞CD4阳性T细胞中是否仍然如此有效呢?接下来,我们在CD4阳性T细胞系中稳定表达BIV Vif,实验证明,在BIV Vif的表达不影响细胞周期和增殖的前提下,BIV Vif在CD4阳性T细胞中能够有效抑制HIV-1的增殖。综上所述,本研究利用现代生物学技术,首次发现牛艾滋病病毒辅助蛋白Vif可以作为一种外源的抗病毒因子,能够显著抑制HIV-1的产生、感染性和增殖;不仅如此,我们还对BIV Vif拮抗病毒的原因和分子机制进行了深入的研究和探讨,BIV Vif通过在细胞内有效地结合HIV-1 Pr55Gag,抑制了病毒出芽后的成熟过程,从而显著地抑制了HIV-1感染性、复制和增殖;同时我们首次发现HIV-1 Vif、SIV Vif和BIV Vif都可以与HIV-1 Pr55Gag相互结合,这是首次在真核细胞中鉴定出二者的相互结合;更进一步,我们还鉴定出了二者相互结合的决定域。这些发现无论是为后续相关研究的进行还是抗病毒治疗新策略的开发都提供了重要的理论基础和潜在靶点。
【关键词】:病毒感染性因子 BIV Vif HIV-1衣壳前体蛋白 Ⅰ型人免疫缺陷病毒
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373
【目录】:
  • 前言4-5
  • 中文摘要5-8
  • ABSTRACT8-14
  • 主要英文缩略词表14-16
  • 第1章 绪论16-34
  • 1.1 背景知识16-31
  • 1.1.1 艾滋病与免疫缺陷病毒16-21
  • 1.1.2 病毒辅助蛋白和宿主抗病毒因子21
  • 1.1.3 Vif蛋白与APOBEC21-26
  • 1.1.4 Vif蛋白与细胞周期26-28
  • 1.1.5 病毒成熟与病毒感染28-31
  • 1.1.6 病毒成熟抑制剂31
  • 1.2 论文设计31-34
  • 1.2.1 论文目的和意义31-32
  • 1.2.2 实验思路和设计32-34
  • 第2章 材料与方法34-58
  • 2.1 材料、仪器和试剂34-42
  • 2.1.1 菌株34
  • 2.1.2 质粒构建34-38
  • 2.1.3 抗体及相关试剂38-39
  • 2.1.4 工具酶和化学试剂39-41
  • 2.1.5 引物合成和测序41
  • 2.1.6 细胞系41
  • 2.1.7 主要仪器41-42
  • 2.2 实验方法42-58
  • 2.2.1 聚合酶链式反应(PCR)42-43
  • 2.2.2 DNA的纯化回收43-44
  • 2.2.3 T载体蓝白斑筛选44
  • 2.2.4 连接反应44-45
  • 2.2.5 感受态细胞的转化45
  • 2.2.6 质粒提取45-47
  • 2.2.7 细胞培养和细胞系的构建47
  • 2.2.8 细胞转染47-48
  • 2.2.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹48-51
  • 2.2.10 免疫共沉淀51
  • 2.2.11 细胞感染51-52
  • 2.2.12 病毒感染性的测定52
  • 2.2.13 病毒的初步纯化以及感染性病毒核心的纯化52-53
  • 2.2.14 电镜观察病毒颗粒53-54
  • 2.2.15 细胞周期的检测54
  • 2.2.16 病毒增殖的检测54-55
  • 2.2.17 酶联免疫吸附实验55
  • 2.2.18 多序列比对55-56
  • 2.2.19 蛋白电泳条带的相对定量56
  • 2.2.20 蛋白表面位点的分析56
  • 2.2.21 统计学方法56-58
  • 第3章 结果与讨论58-107
  • 3.1 BIV Vif抑制HIV-1 的产生和感染性58-63
  • 3.1.1 BIV Vif抑制HIV-1 的感染能力58-60
  • 3.1.2 BIV Vif减少细胞分泌HIV-160-61
  • 3.1.3 BIV Vif以剂量依赖方式抑制HIV-1 的感染性61-63
  • 3.1.4 小结63
  • 3.2 BIV Vif干扰HIV-1 颗粒的成熟63-68
  • 3.2.1 BIV Vif干扰HIV-1 衣壳蛋白前体的剪切63-64
  • 3.2.2 BIV Vif抑制具有感染性的成熟病毒颗粒的产生64-68
  • 3.2.3 小结68
  • 3.3 BIV、HIV-1 和SIV Vif与HIV-1 Gag的相互结合作用68-79
  • 3.3.1 BIV、HIV-1 和SIV Vif与HIV-1 Gag相互结合68-69
  • 3.3.2 BIV Vif与HIV-1 Gag相互结合较HIV-1 和SIV Vif更为有效69-72
  • 3.3.3 病毒载体表达的HIV-1Vif与HIV-1 Gag相互结合72-74
  • 3.3.4 BIV Vif与HIV-1 Gag相互结合较其与BIV Gag更为有效74-75
  • 3.3.5 BIV Vif与HIV-1 Gag相互结合部分依赖于RNA75-76
  • 3.3.6 来源于临床的不同 HIV-1 Vif 克隆与 HIV-1 Gag 相互结合水平相当76-78
  • 3.3.7 小结78-79
  • 3.4 鉴定Pr55~(Gag)中对Vif-Gag相互结合的决定域79-83
  • 3.4.1 构建Pr55~(Gag)的截短体79
  • 3.4.2 鉴定Pr55~(Gag)中对HIV-1 Vif-Gag相互结合的决定域79-81
  • 3.4.3 鉴定Pr55~(Gag)中对BIV Vif-Gag相互结合的决定域81-82
  • 3.4.4 小结82-83
  • 3.5 鉴定Vif中对Vif-Gag相互结合的决定域83-96
  • 3.5.1 鉴定HIV-1、SIV和BIV Vif表面的保守位点83-86
  • 3.5.2 鉴定HIV-1 Vif中对Vif-Gag相互结合的位点86-88
  • 3.5.3 鉴定BIV Vif中对Vif-Gag相互结合的位点88-90
  • 3.5.4 促进HIV Vif的表达抑制HIV-1 的感染能力90-92
  • 3.5.5 构建HIV Vif的截短体92-93
  • 3.5.6 鉴定HIV-1 Vif中对Vif-Gag相互结合的结构域93-95
  • 3.5.7 鉴定BIV Vif中对Vif-Gag相互结合的结构域95-96
  • 3.5.8 小结96
  • 3.6 BIV Vif在CD4阳性T细胞中抑制HIV-1 的复制96-104
  • 3.6.1 BIV Vif对细胞周期没有显著影响96-98
  • 3.6.2 BIV Vif在CD4阳性T细胞系中抑制HIV-1 的复制98-103
  • 3.6.3 小结103-104
  • 3.7 讨论104-107
  • 第4章 结论107-108
  • 参考文献108-119
  • 作者简介及在学期间所取得的科研成果119-122
  • 致谢122

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