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《吉林大学》 2017年
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人类肠道病毒68型干扰宿主细胞周期以促进自身病毒复制的机制研究

王增艳  
【摘要】:背景:人类肠道病毒68型(EV-D68)可在儿童中引起严重的呼吸系统疾病,且在某些严重病例中可发生急性弛缓性瘫痪及颅脑神经功能障碍等严重的神经系统并发症,是一种可致命的病原体。EV-D68首次发现于1962年,是从加利福尼亚州的4名患有肺炎及支气管炎的儿童体内分离提取出的。在过去的10年里,意大利、美国、德国、中国及几个其他的国家均有EV-D68感染爆发的报道。且在2014年,在美国和加拿大爆发了截至目前为止规模最大,波及范围最广泛且伴随着严重的临床表现的EV-D68感染。不幸的是,针对EV-D68感染目前没有特效的预防用的疫苗及治疗用的药物。这主要是由于截至目前为止,我们对于EV-D68复制所需要的宿主细胞的细胞因子所知甚少。众所周期,许多病毒是通过调节宿主细胞的细胞周期进程来促进自身的复制,这是它们致病机制中的一个特征。在之前的研究中,我们发现人类肠道病毒71型(EV-A71)和柯萨奇病毒A16(CA16)都可以引起宿主细胞S期阻滞以促进其本身的病毒复制。然而EV-D68是否存在潜在的细胞周期操控能力,且其对细胞周期的操控能力是否与其最近爆发时的强致病性及致死性有关等问题到目前为止都没有被研究。目的:在本次研究中,我们针对不同细胞周期状态对EV-D68复制的影响及EV-D68对宿主细胞周期的操控能力进行了探讨。以求进一步增加对EV-D68致病机理的理解,并且尽力为日后EV-D68感染相关疾病的预防及特异性抗病毒治疗提供潜在的靶点。方法:为了研究不同细胞周期状态对EV-D68复制的影响及EV-D68病毒对宿主细胞的细胞周期方面的影响,我们以无血清的DMEM培养RD细胞使细胞处于G0/G1期同步化状态,以0.85 m M的胸腺嘧啶核苷处理RD细胞使其处于S期同步化状态,且以25 ng/ml的诺考达唑处理细胞使其处于G2/M期同步化状态。在实验过程中,我们通过流式细胞术来测定宿主细胞的细胞周期曲线,且通过Mod Fit LT软件来分析处于不同细胞周期阶段的细胞占总细胞数的百分比。在基因水平,我们通过实时定量PCR技术测定RD细胞内EV-D68的RNA水平及各种细胞周期相关蛋白的m RNA表达水平。为了测定病毒的毒力,我们以滴定法测定上清液中的子代病毒。我们通过半定量的蛋白免疫印迹方法(western blot)对EV-D68感染后细胞周期相关蛋白的调节进行了分析,且利用Elisa试剂盒对各种细胞周期相关蛋白的表达量进行了测定以验证蛋白免疫印迹所得结果的正确性。结果:实验结果表明,同步化宿主细胞周期到G0/G1期可以促进EV-D68扩增,S期同步化没有促进病毒扩增的能力,但G2/M期同步化可以抑制病毒的复制。无论是最早被分离的EV-D68的Fermon株,还是目前正在全球范围内流行的EV-D68的几株流行株都可以调控宿主细胞的细胞周期使其发生G0/G1期阻滞,进而为EV-D68病毒的复制提供最适宜的环境。从蛋白质表达水平和/或相应基因的m RNA的表达水平上可以发现,EV-D68对细胞周期的调节与细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶表达的相关作用有关。此外,我们还发现,EV-D68的病毒非结构蛋白3D可以阻止细胞周期由G0/G1期进入S期。有趣的是,EV-D68与EV-A71虽同为肠道病毒,但G0/G1期同步化并不能促进EV-A71的复制,相反G0/G1期同步化却抑制EV-A71的复制。然而,这两种病毒却存在一个相似点:G2/M期同步化对这两种病毒的复制及活性均起到抑制作用,这为肠道病毒的常规治疗提供了一个靶点和方向。这些结果进一步的解释了肠道病毒特别是EV-D68的致病机制,且为日后EV-D68相关疾病的预防和治疗提供了潜在的策略。结论:不同于对EV-A71的研究,本次研究的结果表明EV-D68显示出了增加宿主细胞中G0/G1期细胞所占百分比的显著能力,且G0/G1期是EV-D68进行复制的最适宜的环境。且我们还发现G2/M期阻滞既可以抑制EV-D68的复制也可以抑制EV-A71的复制。因此,我们推测诱导G2/M阻滞的药物可以被认为是抑制不同类型的肠道病毒感染的通用抗病毒疗法。这为将来抗肠道病毒及抗EV-D68药物的发展提供了新的方向。
【关键词】:人类肠道病毒68型(EV-D68) 细胞周期 G0/G1期阻滞 病毒复制 宿主-病原体相互作用
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373.2
【目录】:
  • 前言4-6
  • 中文摘要6-9
  • Abstract9-14
  • 第1章 绪论14-32
  • 1.1 病毒背景知识介绍14-19
  • 1.1.1 肠道病毒及EV-D68的概述14-15
  • 1.1.2 EV-D68的流行病学特点15-16
  • 1.1.3 EV-D68的生物学特性16-19
  • 1.2 EV-D68感染的临床特点及研究现状19-22
  • 1.2.1 EV-D68感染的临床特点19-21
  • 1.2.2 EV-D68的预防、诊断及治疗现状21-22
  • 1.3 细胞周期及其调控22-28
  • 1.3.1 细胞周期的概述22-24
  • 1.3.2 调控细胞周期的机制24-28
  • 1.4 病毒与宿主细胞周期之间的相互影响28-30
  • 1.5 研究目标30-32
  • 第2章 材料和方法32-46
  • 2.1 实验材料、仪器和试剂32-37
  • 2.1.1 细胞系、病毒和菌株32
  • 2.1.2 抗体32-33
  • 2.1.3 质粒构建及实时荧光定量PCR所用引物33-34
  • 2.1.4 主要仪器34-35
  • 2.1.5 主要试剂35-37
  • 2.2 实验方法37-46
  • 2.2.1 细胞培养37
  • 2.2.2 细胞转染37-38
  • 2.2.3 病毒感染细胞38
  • 2.2.4 细胞周期释放38-39
  • 2.2.5 细胞周期同步化39
  • 2.2.6 使用流式细胞仪进行细胞周期分析39-40
  • 2.2.7 质粒构建40-42
  • 2.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印记42-43
  • 2.2.9 实时荧光定量PCR43-44
  • 2.2.10 病毒滴度的测定(TCID50法)44-45
  • 2.2.11 Elisa法蛋白定量测定45-46
  • 第3章 实验结果与讨论46-68
  • 3.1 细胞周期同步化对EV-D68复制的影响46-49
  • 3.2 EV-D68感染宿主后可介导细胞G0/G1期阻滞49-52
  • 3.3 EV-D68感染可抑制细胞由G0/G1期转入S期52-54
  • 3.4 EV-D68感染可促进细胞由G2/M期进入G0/G1期54-57
  • 3.5 EV-D68非结构蛋白 3D和 3C可介导细胞周期改变57-59
  • 3.6 G0/G1期同步化对EV-D68和EV-A71病毒复制有不同的影响59-61
  • 3.7 G2/M期同步化对EV-D68和EV-A71复制有相似的抑制作用61-64
  • 3.8 讨论64-68
  • 第4章 结论68-70
  • 参考文献70-83
  • 作者简介及在读期间所取得的科研成果83-85
  • 致谢85

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