收藏本站
《吉林大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

CRISPR-Cas9染色质免疫共沉淀技术揭示细胞重编程中多能基因Sox2、Oct4启动子的DNA-IncRNA结合网络

张诗林  
【摘要】:研究背景和研究目的:诱导体细胞逆分化为具有多能性的胚胎干细胞的过程称之为细胞重编程。科学家们一直在努力探索细胞重编程的方法,以便将干细胞广泛的应用于科学研究以及临床治疗。一直以来对体细胞重编程方法的研究进展有限,已知的方法,如细胞核移植,细胞融合以及干细胞去核提取物孵育体细胞的方法都存在缺陷,很难得到能够发育为成熟胚胎的干细胞,并且存在道德、伦理的争议。人工诱导多能干细胞的成功制备给了科学家们新的希望。人工诱导性多能干细胞是由日本科学家Yamanaka在2006年首次将4种多能性相关转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc转入体细胞中得到的,命名为人工诱导性多能干细胞(i PSC)。i PSC的发现不仅是人们应用多能干细胞的希望,同样也为人们提供了新的视角,探索将多能性相关转录因子引入细胞后,体细胞逆分化为多能干细胞以及多能干细胞维持干性的机理。但是,在这一过程中,何种因子参与重编程调控,有多少因子在多能性因子的内源性表达上起到了关键的作用,如与多能基因Sox2和Oct4启动子相互作用,在重编程中激化内源性多能基因,目前依然是空白。本实验的主要目的是找到细胞重编程过程中能够参与Sox2和Oct4内源性表达,即能够与Sox2和Oct4启动子相互作用的因子,尤其是调控重编程的长链非编码RNA(lnc RNA),进而探讨人工诱导性多能干细胞在形成过程中的机制,找到启动这一过程的关键节点,以便提高重编程转化效率,在未来更好的调控这一过程。研究方法:实验中我们应用了CRISPR-Cas9技术来探索诱导性多能干细胞形成以及维持多能性可能的机制及原理。CRISPR-Cas9作为近10年来发现并应用十分广泛的基因编辑工具,是由一段特异的长度大约20bp左右的RNA靶向序列-通用的结构支架(sg RNA)和Cas9核酸内切酶组成,通常用于靶向切除某些基因,起到研究或者治疗的作用。CRISPR-Cas9的特点在于它的靶向性,因其携带的特异性sg RNA能够特异性的结合在目的基因处,并将Cas9蛋白结合在该处,作为分离目的基因的媒介。我们首先转入带有Sox2、Oct4启动子序列的sg RNA的Lenti-CRISPR质粒,经过筛选后获得能够稳定携带Cas9-g RNA基因的细胞。通过细胞固定将Cas9蛋白、Sox2与Oct4启动子特异性sg RNA以及能够和启动子结合的分子,如DNA、lnc RNA甚至是蛋白质结构固定在一起形成复合物。我们的实验中主要研究了能够和Sox2与Oct4启动子结合的DNA以及lnc RNA,由于RNA的稳定性较低,所以两者的方法略有不同。在研究和启动子相互作用的DNA时,我们通过Cas9特异性抗体将Cas9复合物从超声破碎后的细胞提取液中分离出来,通过解交联解开复合物的联接,并用DNA提纯的方法获得Cas IP DNA样品,制作基因文库,并应用Ch IP-seq方法进行测序。而在研究和启动子相互作用的lnc RNA时,我们在固定细胞后,首先在细胞内将RNA逆转录为c DNA并用Biotin-CTP标记,以便保证RNA分析的稳定。然后重复Cas9抗原抗体反应以及免疫共沉淀方法,之后利用生物素亲和素的结合分离出被Biotin-CTP标记的、参与Sox2、Oct4启动子结合的lnc RNA,同样进行Ch IP-seq测序对样本进行分析。研究结果:Cas IP、Ch IP-seq分析结果发现能够和Sox2、Oct4启动子结合的多种因子参与到了很多重要的细胞生理过程中。对测序结果进一步分析发现并且在PCR结果中证实了位于小鼠17号染色体上的Oct4基因与位于3号染色体上的Sox2基因启动子在多个位点上存在相互作用,而Sox2/Oct4启动子也和Sox2/Oct4基因本身在多个位点相互联系,其中的启动子与增强子区域能够形成特异的启动子-增强子染色质内环结构。这种染色体之间以及染色体之内形成的空间构架只存在于诱导性多能干细胞中,而并没有在多能基因不表达的未重编程的小鼠成纤维细胞中发现。这一结果证明了在体细胞重编程过程中,Oct4和Sox2,Sox2和Sox2以及Oct4和Oct4基因之间存在许多的相互作用,并且这些相互作用可能在促进细胞重编程以及维持多能性上具有很重要的作用。同时在RT-Cas IP的Ch IP-seq测序结果中发现了能够与Sox2/Oct4基因启动子相互作用的lnc RNA在IPSC和FBC中存在显著差异。这一结果证明了这些lnc RNA能够参与到细胞重编程过程中,并且通过调动Sox2/Oct4的远端增强子到近端启动子的过程在细胞重编程与多能性的维持上起到关键作用。实验结论:通过Cas IP方法以及Ch IP-seq测序,我们发现,位于3号染色体上的Sox2基因的启动子与位于17号染色体上的Oct4基因以及Sox2基因形成远端增强子-启动子-DNA环。使用RT-Cas IP-Seq测定发现,一些长链非编码RNA(lnc RNA),如Palr5,Palr8,Palr9具有结合DNA的能力并且主动参与Sox2-Oct4相互作用,调动远处增强子与近端启动子形成染色质环,促进核心多能性因子的表达。这种染色质空间折叠在促进细胞恢复以及维持多能性上具有很重要的作用。
【关键词】:IPSC 体细胞重编程 CRISPR-Cas9 Sox2 Oct4 染色质启动子—增强子环状结构
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R329.2
【目录】:
  • 摘要4-7
  • Abstract7-13
  • 中英文缩略词对照表13-14
  • 第1篇 综述14-34
  • 第1章 体细胞重编程方法的起源与进展14-24
  • 1.1 体细胞核移植(SCNT)方法14-15
  • 1.2 细胞融合方法15-16
  • 1.3 细胞提取物介导的体细胞重编程16
  • 1.4 转录因子介导的iPSCs技术16-24
  • 1.4.1 IPS细胞在疾病模型中的应用于进展16-20
  • 1.4.2 IPS细胞在再生医学与药物筛选中的应用于进展20-24
  • 第2章 体细胞重编程的机制24-28
  • 2.1 基因表达的表观影响24
  • 2.1.1 DNA甲基化24
  • 2.1.2 组蛋白修饰24
  • 2.2 非编码RNA24-25
  • 2.3 染色质重塑25-26
  • 2.4 lncRNA-染色质内环结构-干性基因调控26-28
  • 第3章 CRISPR-Cas9研究进展28-34
  • 3.1 CRISPR-Cas9在生命科学中的应用28-32
  • 3.1.1 CRISPR-Cas9用于清除特定基因28-30
  • 3.1.2 CRISPR-Cas9用于筛选基因文库30-32
  • 3.2 为改进方法对CRISPR-Cas9做的改造32-34
  • 第2篇 实验部分34-94
  • 第1章 仪器与材料34-42
  • 1.1 细胞34
  • 1.2 质粒34
  • 1.3 仪器与耗材34-35
  • 1.4 细胞培养试剂35-36
  • 1.5 试剂及主要试剂的配置:36-42
  • 第2章 实验方法42-62
  • 2.1 细胞培养42
  • 2.2 RNA提取及c DNA合成42-44
  • 2.3 DNA提取44
  • 2.4 质粒的构建44-46
  • 2.4.1 Lenti-Cas9质粒44-46
  • 2.4.2 ES-pMD2.G质粒46
  • 2.5 慢病毒包装46-48
  • 2.6 细胞的慢病毒感染及筛选48-49
  • 2.7 Cas9IP方法49-53
  • 2.7.1 细胞的收集与固定49
  • 2.7.2 超声破碎细胞49
  • 2.7.3 Cas9-gRNA与特异性抗体的结合49-50
  • 2.7.4 Cas9-gRNA与Protein A/G磁珠结合与洗脱50
  • 2.7.5 Cas9-gRNA蛋白复合物的解交联50-51
  • 2.7.6 DNA的提纯51
  • 2.7.7 样品质量的初步验证51-53
  • 2.8 建立Cas9IP DNA文库53-54
  • 2.9 RT-Cas9IP方法54-60
  • 2.9.1 细胞的收集与固定54
  • 2.9.2 细胞内逆转录合成cDNA54-55
  • 2.9.3 超声破碎细胞55
  • 2.9.4 Cas9-gRNA与特异性抗体的结合55-56
  • 2.9.5 Cas9-gRNA与Protein A/G磁珠结合与洗脱56
  • 2.9.6 Cas9-gRNA生物素-亲和素结合56-57
  • 2.9.7 Cas9-gRNA蛋白复合物的解交联57
  • 2.9.8 DNA的提纯57-58
  • 2.9.9 样品质量的初步验证58-60
  • 2.10 建立RT-Cas9IP DNA文库60-62
  • 第3章 实验结果与分析62-88
  • 3.1 细胞培养结果62
  • 3.2 cDNA合成结果62-63
  • 3.3 DNA提取结果63
  • 3.4 质粒的构建结果63-65
  • 3.5 慢病毒包装,病毒感染及筛选结果65-66
  • 3.6 CasIP结果66-68
  • 3.6.1 细胞的固定与超声破碎66
  • 3.6.2 抗体孵育与免疫共沉淀66-68
  • 3.7 DNA ChIP-seq结果68-80
  • 3.7.1 ChIP-seq测序总体结果68-74
  • 3.7.2 Sox2与Oct4基因的染色质间(inter-chromosomal)相互连接作用74-76
  • 3.7.3 Sox2基因在重编程中形成特异启动子—增强子染色质内环(intra-chromosomal looping)结构76-79
  • 3.7.4 Oct4基因在重编程中形成特异启动子-增强子染色质内环(intra-chromosomal looping)结构79-80
  • 3.8 RT-CasIP筛查与多能基因启动子结合的 IncRNA80-88
  • 第4章 讨论88-92
  • 第5章 结论92-94
  • 参考文献94-106
  • 作者简介及在学期间所取得的科研成果106-108
  • 致谢108

【相似文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 张诗林;CRISPR-Cas9染色质免疫共沉淀技术揭示细胞重编程中多能基因Sox2、Oct4启动子的DNA-IncRNA结合网络[D];吉林大学;2017年
中国知网广告投放
相关机构
>吉林大学
相关作者
>张诗林
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026