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《吉林大学》 2017年
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Ⅰ型干扰素通过增加TRIM25的表达抑制HBV复制的机制研究

肖庆飞  
【摘要】:HBV入侵人体后可引起慢性乙型病毒性肝炎,最终进展至肝硬化、肝癌。HBV因为能抑制人体的各种天然和获得性免疫应答,从而引起免疫耐受,因此目前临床治疗HBV感染的效果并不理想。I型干扰素是目前经批准的用于治疗慢性乙型肝炎的药物之一,但是I型干扰素除了有很多副作用外,其抗病毒治疗效果也有限,且其抗病毒作用的具体机制及其下游信号通路仍不清楚。TRIM25是一种干扰素刺激基因,在对RIG-I的K63泛素化修饰和活化过程中起到重要的作用。在肝细胞中由I型干扰素诱导的TRIM25的表达是否能起到抗HBV的作用目前仍然不清楚,为了提高抗病毒治疗效果,寻找更有效的抗病毒药物,我们利用分子克隆、q PCR、WB、Elisa等方法,在基因和蛋白水平上对TRIM25和HBV之间相互作用关系进行了初步探索。我们的研究结果提示:(1)干扰素可以诱导TRIM25的表达:干扰素诱导TRIM25的表达依赖于分泌到细胞外的某种细胞因子;IL27对于TRIM25的诱导表达非常关键;IL27受干扰素直接诱导表达;IL27中和抗体可以阻断干扰素对TRIM25的诱导表达;IL27R1的敲除阻断了干扰素对TRIM25的诱导表达;IL27R1敲除的BMMs中干扰素对TRIM25的诱导表达被阻断。(2)IL27诱导TRIM25的表达依赖于STAT1和STAT3:IL27可以激活STAT1/3;STAT3特异性抑制剂可以抑制干扰素诱导的TRIM25的表达。(3)TRIM25可以抑制HBV的复制:Hep G2细胞中过表达TRIM25可以抑制p HBV的HBVDNA及HBe Ag;Hep G2.2.15细胞系中转TRIM25质粒后HBV的复制受到抑制;TRIM25敲除促进HBV复制。(4)STAT3对于抑制HBV的复制是很重要的:STAT3敲除促进HBV复制。(5)TRIM25在Hep G2细胞中促进干扰素的生成:TRIM25的过表达和敲除影响干扰素的本底表达;TRIM25敲除后抑制IFNβ及ISRE启动子活性;TRIM25敲除抑制p HBV对干扰素诱导基因的诱导表达。(6)HBV可以抑制TRIM25的诱导表达:乙肝病人PBMC中TRIM25的表达明显降低;乙肝病人的血清可以抑制Hep G2细胞中TRIM25的表达;Hep G2.2.15细胞系中TRIM25的表达明显受抑制;Hep G2.2.15培养上清抑制干扰素对TRIM25的诱导表达,提示HBV可能通过某种机制会反过来抑制抗HBV相关的干扰素刺激基因的表达,从而导致干扰素抵抗。我们的研究结果表明,I型干扰素诱导的TRIM25分子的表达是抑制HBV复制的一个重要因素;干扰素通过IL-27依赖的调节回路来促进TRIM25的表达;转录因子STAT1和STAT3均为TRIM25诱导所必须;HBV会抑制TRIM25的表达。因而IFN-IL-27-TRIM25轴可能是治疗HBV感染的新靶点。
【关键词】:HBV I型干扰素 TRIM25 天然免疫
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373.21
【目录】:
  • 中文摘要4-6
  • Abstract6-14
  • 中英文缩略词对照表14-16
  • 第1章 绪论16-20
  • 第2章 文献综述20-44
  • 2.1 识别病原体的天然感受器20-29
  • 2.1.1 RIG-I介导的对于胞浆中RNA的识别21-24
  • 2.1.2 c GAS–STING介导的对胞浆DNA的识别24-26
  • 2.1.3 RNA与DNA感受器通路之间的对话26-28
  • 2.1.4 胞浆内核酸感受器通路的表达水平被共同调控28-29
  • 2.2 TRIM蛋白的抗病毒作用29-34
  • 2.2.1 TRIM家族蛋白的结构和多样性30-32
  • 2.2.2 TRIM蛋白在天然免疫中的作用32
  • 2.2.3 TRIM蛋白在JAK–STAT通路中的作用32-33
  • 2.2.4 TRIM蛋白在DNA感受器介导的信号通路中的作用33-34
  • 2.3 IL-27 分子的功能34-39
  • 2.3.1 IL-27 分子的结构及主要功能34-35
  • 2.3.2 IL-27 分子相关的信号转导通路35-37
  • 2.3.3 IL-27 分子在感染与炎症反应中的作用37-39
  • 2.4 STAT3的结构与功能39-44
  • 2.4.1 STAT3的结构和转录功能39-41
  • 2.4.2 STAT3的过度活化与自身免疫41
  • 2.4.3 STAT3在巨噬细胞中的抗炎作用41-42
  • 2.4.4 STAT3在非免疫细胞中的抗炎作用42-44
  • 第3章 材料与方法44-54
  • 3.1 实验材料44-47
  • 3.1.1 细胞系及细胞培养用品44
  • 3.1.2 野生小鼠及基因敲除小鼠44
  • 3.1.3 抗体和试剂44-46
  • 3.1.4 质粒46-47
  • 3.2 实验方法47-49
  • 3.2.1 RNA提取和实时定量PCR(Q-PCR)47
  • 3.2.2 免疫印迹47
  • 3.2.3 荧光素酶报告系统检测47-48
  • 3.2.4 酶联免疫吸附试验48
  • 3.2.5 CRISPR/Cas9 knockout48-49
  • 3.2.6 细胞培养及外源基因转染49
  • 3.3 病人样本49-53
  • 3.3.1 标本保存50
  • 3.3.2 外周血单个核细胞的提取50-51
  • 3.3.3 PBMC中总RNA的提取51
  • 3.3.4 RNA浓度及质量的检测51-52
  • 3.3.5 RNA逆转成c DNA52-53
  • 3.4 统计学处理方法53-54
  • 第4章 实验结果54-80
  • 4.1 I型干扰素可以诱导TRIM25的表达54-58
  • 4.1.1 I型干扰素对细胞内各种TRIMs基因的诱导表达54-55
  • 4.1.2 干扰素可以诱导TRIM25的表达55-56
  • 4.1.3 干扰素诱导TRIM25的表达依赖于某种细胞因子56-58
  • 4.2 IL27对于TRIM25的诱导表达非常关键58-62
  • 4.2.1 IL27被干扰素直接诱导表达58
  • 4.2.2 IL27中和抗体可以阻断IFN对TRIM25的诱导58-59
  • 4.2.3 IL27R1的敲除阻断了干扰素对TRIM25的诱导59-60
  • 4.2.4 IL27R1敲除的BMMs中TRIM25的诱导表达被阻断60-61
  • 4.2.5 IL27诱导TRIM25的表达依赖于STAT1/361-62
  • 4.3 TRIM25的诱导表达依赖于STAT1和STAT362-66
  • 4.3.1 IL27可以激活STAT1和STAT 362-64
  • 4.3.2 STAT3特异性抑制剂可以抑制TRIM25的表达64-65
  • 4.3.3 干扰素对TRIM25的诱导依赖于STAT1和STAT365-66
  • 4.4 TRIM25可以抑制HBV的复制66-70
  • 4.4.1 TRIM25可以抑制HBV DNA复制及HBe Ag的分泌66-67
  • 4.4.2 TRIM25可以抑制Hep G2.2.15 细胞系中HBV的复制67-69
  • 4.4.3 TRIM25敲除促进HBV复制69-70
  • 4.5 STAT3敲除促进HBV复制70-72
  • 4.6 TRIM25在HEPG2细胞中促进干扰素的生成72-75
  • 4.6.1 TRIM25的过表达和敲除影响干扰素的本底表达72-73
  • 4.6.2 TRIM25敲除后IFNβ或ISRE启动子活性受到抑制73-74
  • 4.6.3 TRIM25敲除抑制p HBV转染后干扰素诱导基因的表达74-75
  • 4.7 HBV 抑制 TRIM25 的诱导表达75-80
  • 4.7.1 慢性乙肝病人及健康对照基本资料75-76
  • 4.7.2 乙肝病人PBMC中TRIM25的表达明显下降76-77
  • 4.7.3 乙肝病人血清可以抑制Hep G2细胞中TRIM25的表达77
  • 4.7.4 Hep G2.2.15 细胞系中 TRIM25 表达明显抑制77-78
  • 4.7.5 Hep G2.2.15 培养上清抑制干扰素对TRIM25的诱导78-80
  • 第5章 讨论80-86
  • 第6章 结论86-88
  • 第7章 创新点88-90
  • 参考文献90-108
  • 作者简介及攻读博士期间科研成果108-110
  • 致谢110

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