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《吉林大学》 2017年
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真菌介导的金属纳米粒子的生物合成及其应用研究

薛柏吉  
【摘要】:纳米技术与生物技术相结合在交叉学科领域取得了重要进展,并正以难以预料的速度向前发展。纳米技术的出现,使得金属材料在尺寸上变小,这种变化不仅保留了金属本身良好特质,而且使其在应用方面有了质的飞跃。由于纳米粒子具有催化效应、小尺寸效应、表面效应以及量子效应等特性,使其在光电、生物、磁性、催化及医学等方面被广泛应用。目前,有关金属纳米粒子的合成方法主要有三种,包括物理法、化学法及生物法。随着绿色、环保观念的普及,利用生物系统合成金属纳米粒子的生物法备受关注。生物法是环境友好的方法,它廉价、可持续发展、反应条件温和、产物稳定,且不使用刺激的、毒性的化学试剂。无论是简单的原核生物,还是复杂的真核生物,都有可能被用于合成纳米粒子。而这些生物主要包括三类“成员”,即植物、细菌及真菌。与植物和细菌相比,真菌代谢产物丰富、能够分泌多种酶类,现已成为生物法合成纳米粒子的主力军之一。而在重金属中,银和金纳米粒子是最常见的纳米粒子,由于其自身的特殊性质而被应用于多个领域,包括光学、催化、环保及医学等领域。本研究旨在从环境(土壤和植物)中分离获得真菌,发挥其代谢产物丰富的特长,挖掘出具有金属纳米粒子(主要是纳米银和金)生物合成活性的真菌菌株;通过优化生物合成的过程,得到金属纳米粒子的最佳合成条件;并利用金属纳米粒子进行抗真菌活性分析和制备人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测试纸条。具有金属纳米粒子生物合成活性菌株的分离、鉴定:本研究从8份土壤样本和18份植物样本(来自于6种植物)中,分别分离获得真菌145株和135株。从上述280株真菌中,初步筛选到具有纳米银或金生物合成活性的菌株22株,其中菌株S6-6(合成纳米银)和HB-8(既能合成纳米银,又能合成纳米金)的生物合成能力较强、合成的粒径较小。利用形态学与分子生物学相结合的方法,鉴定未知菌株是最常用、最普遍的研究方法。本研究亦利用了此方法,鉴定菌株S6-6为粉节皮菌(Arthroderma fulvum),鉴定菌株HB-8为秘鲁小帚梗柱孢霉(Cylindrocladiella peruviana)。利用菌株S6-6生物合成了纳米银:生物合成了纳米银,并对其合成过程的二次发酵条件和合成条件的主要参数进行了优化,得到最适的二次发酵条件为:菌体接种量4g,静止孵育8h;最适的合成条件为:底物Ag NO3浓度为1.5m M,反应温度为55°C,反应时间10h。使用透射电子显微镜(TEM),X射线衍射(XRD)及粒度分析仪对生物合成的纳米银进行表征,纳米银为球型或近球型,平均粒径为20.56nm,具有面心六面体晶体结构。对生物合成的纳米银进行了抗真菌活性研究:微量稀释法药敏试验表明:生物合成的纳米银对所有受试菌株均有效,其MIC在0.125~4μg/ml范围内。氟康唑对假丝酵母属有抗菌作用(MIC为0.250~16.0μg/ml),而对曲霉属和镰刀菌属均无效(MIC64.0μg/ml)。伊曲康唑对镰刀菌属无效(MIC16.0μg/ml)外,对假丝酵母属和曲霉属均有效(MIC为0.030~0.250μg/ml)。与氟康唑和伊曲康唑相比,生物合成的纳米银具有更广的抗菌谱。棋盘稀释法联合药敏试验表明:作用于白假丝酵母,生物合成的纳米银与氟康唑或伊曲康唑两种抗真菌药为相加作用;作用于烟曲霉,生物合成的纳米银与伊曲康唑存在相加作用,而与氟康唑表现为无关。XTT减低法表明:当生物合成的纳米银的浓度为2.00μg/ml和1.00μg/ml时,分别对白假丝酵母和烟曲霉生物膜的抑制率达到约50%。生物合成的纳米银能够抑制白假丝酵母和烟曲霉生物膜的生成;亦得到结论:生物膜的固着细胞抵抗药物浓度的能力要强于浮游细胞。超微结构分析结果表明:生物合成的纳米银破坏了白假丝酵母和烟曲霉生物膜的完整性;纳米银可能通过影响真菌细胞壁而起到抗真菌作用。利用菌株HB-8生物合成了纳米银和金:生物合成了纳米银和金,并对其合成过程的二次发酵条件和合成条件的主要参数进行了优化,得到合成纳米银最适的条件为:菌体接种量4g、二次发酵时间6h、振荡培养转速为120rpm、底物Ag NO3的浓度2.0m M、反应温度35?C、反应时间8h;合成纳米金最适的条件为:菌体接种量3g,二次发酵时间8h,振荡培养转速为180rpm,底物HAu Cl4的浓度1.0m M,反应温度25?C,反应时间6h。使用TEM,XRD,傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)及粒度分析仪对生物合成的纳米银和金进行表征,得到了粒径约为62.18nm的纳米银和47.13nm的纳米金。生物合成的纳米金应用于HCG检测试纸条:本研究利用胶体金(生物金和化学金)制备了HCG检测试纸条,并对两种HCG检测试纸条的几项重要性能进行了评估、分析。从测试结果得出结论:生物金和化学金试纸条的灵敏度分别为15m IU/ml和20m IU/ml,表明生物金试纸条的灵敏度较高;两种试纸条均具有良好的特异性、重复性,且均无HOOK效应;在稳定性测试过程中,考察了两种试纸条的热稳定性,在37?C条件下,生物金试纸条至少可以保存35d而保持其性能稳定,即显示为阳性结果,而化学金试纸条至少可以保存28d,表明生物金试纸条具有更好的热稳定性。在几项重要性能测试中,在特异性、重复性及HOOK效应方面,两种试纸条无明显区别,而在灵敏度和稳定性方面,相比于化学金试纸条,生物金试纸条表现出更好的效果。综上,本研究获得了具有生物合成金属纳米粒子活性的真菌菌株:粉节皮菌(Arthroderma fulvum)和秘鲁小帚梗柱孢霉(Cylindrocladiella peruviana),而且对生物合成的纳米银在抗真菌研究做了初步探讨。此外,本研究对生物合成的纳米金在HCG检测试纸条的应用进行了研究,可能为其应用在胶体金免疫层析技术以及其他检测技术提供理论依据和技术支持。
【关键词】:生物合成法 纳米银 抗真菌 纳米金 胶体金免疫层析
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TB383.1;Q81
【目录】:
  • 摘要4-7
  • Abstract7-14
  • 第1章 绪论14-32
  • 1.1 生物法合成纳米粒子的研究现状14-25
  • 1.1.1 植物生物合成纳米粒子15-17
  • 1.1.2 细菌生物合成纳米粒子17-19
  • 1.1.3 真菌生物合成纳米粒子19-25
  • 1.2 纳米粒子的应用简述25-31
  • 1.2.1 银纳米粒子的应用26-29
  • 1.2.2 金纳米粒子的应用29-31
  • 1.3 本研究的目的意义和主要内容31-32
  • 1.3.1 目的意义31
  • 1.3.2 主要内容31-32
  • 第2章 真菌的分离及具有纳米粒子生物合成活性菌株的筛选32-42
  • 2.1 材料32-33
  • 2.1.1 土壤材料和植物材料32
  • 2.1.2 主要试剂32-33
  • 2.1.3 主要仪器33
  • 2.2 方法33-36
  • 2.2.1 土壤真菌的分离33-34
  • 2.2.2 植物内生真菌的分离34
  • 2.2.3 具有纳米粒子生物合成活性菌株的筛选34-36
  • 2.3 结果与讨论36-41
  • 2.3.1 土壤真菌和植物内生真菌分离结果36-38
  • 2.3.2 具有纳米粒子生物合成活性的菌株38-41
  • 2.4 小结41-42
  • 第3章 菌株S6-6 介导纳米银的生物合成及其抗真菌研究42-64
  • 3.1 材料42-44
  • 3.1.1 实验菌株42
  • 3.1.2 主要试剂42-43
  • 3.1.3 主要仪器43-44
  • 3.2 方法44-49
  • 3.2.1 菌株S6-6 的鉴定44
  • 3.2.2 纳米银的生物合成44-45
  • 3.2.3 生物合成纳米银的条件优化45
  • 3.2.4 纳米银的表征45
  • 3.2.5 纳米银的抗真菌研究45-49
  • 3.3 结果与讨论49-63
  • 3.3.1 菌株S6-6 的鉴定49-51
  • 3.3.2 纳米银的生物合成51-52
  • 3.3.3 生物合成纳米银的条件优化52-55
  • 3.3.4 纳米银的表征55-57
  • 3.3.5 微量稀释法分析纳米银的抗真菌活性57-59
  • 3.3.6 纳米银与抗真菌药物联合作用于白假丝酵母和烟曲霉59
  • 3.3.7 纳米银作用于白假丝酵母和烟曲霉,对其生物膜的抑制作用和超微结构的影响59-63
  • 3.4 小结63-64
  • 第4章 菌株HB-8 介导纳米银和金的生物合成及纳米金在HCG检测试纸条的应用64-98
  • 4.1 材料64-67
  • 4.1.1 实验菌株64
  • 4.1.2 主要试剂64-66
  • 4.1.3 主要仪器66-67
  • 4.2 方法67-75
  • 4.2.1 菌株HB-8 的鉴定67
  • 4.2.2 纳米银和金的生物合成67-68
  • 4.2.3 生物合成纳米银和金的条件优化68
  • 4.2.4 纳米银和金的表征68-69
  • 4.2.5 纳米金在HCG检测试纸条的应用69-75
  • 4.3 结果与讨论75-95
  • 4.3.1 菌株HB-8 的鉴定75-76
  • 4.3.2 纳米银和金的生物合成76-79
  • 4.3.3 生物合成纳米银和金的条件优化79-83
  • 4.3.4 纳米银和金的粒度分析和透射电子显微镜观察83-84
  • 4.3.5 纳米银和金的X射线衍射和傅里叶红外光谱观察84-85
  • 4.3.6 金标抗体制备的最佳pH85-86
  • 4.3.7 金标抗体制备的最小结合蛋白量86-87
  • 4.3.8 样品垫处理液中表面活性剂浓度的确定87-88
  • 4.3.9 样品垫处理液中稳定剂浓度的确定88-89
  • 4.3.10 醋酸纤维膜上抗体蛋白的固定89-90
  • 4.3.11 试纸条的灵敏度测试结果90-92
  • 4.3.12 试纸条的特异性测试结果92
  • 4.3.13 试纸条重复性测试结果92-93
  • 4.3.14 试纸条稳定性测试结果93-94
  • 4.3.15 试纸条HOOK效应测试结果94-95
  • 4.4 小结95-98
  • 第5章 结论98-100
  • 参考文献100-116
  • 作者简介及在学期间所取得的科研成果116-117
  • 致谢117

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