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《吉林大学》 2017年
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金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15的抗原性及其代谢动力学

张蕾  
【摘要】:金黄色葡萄球菌是一种普遍存在的人畜共患病原菌,其可以造成多种局部和全身性感染,具有高发病率和死亡率。由金黄色葡萄球菌引起的感染是威胁人类健康的主要问题。严重地威胁人类的健康和公共卫生安全。近些年,由于多重耐药金黄色葡萄球菌的广泛流行,给该菌造成感染的治疗带来了巨大的困难。噬菌体裂解酶可以高效、特异地裂解细菌,因其与抗生素的作用机制完全不同,是新概念的抗菌物质,有着很大的研究与应用潜力。本实验室在前期研究过程中获得了金黄色葡萄球菌的噬菌体裂解酶(LysGH15),该裂解酶对金黄色葡萄球菌具有广谱、高效裂解活性,不但可以杀灭抗生素敏感的金葡菌,对多重耐药的金葡菌同样有效;已成功解析了LysGH15的三维结构、揭示了其高效杀菌活性的分子作用机制;LysGH15在体内表现出良好的治疗效果。但作为一种潜在的新型蛋白酶类药物,LysGH15是否会诱导金葡菌产生耐药性,其在体内的抗原性和代谢动力学尚不清楚,而这是其作为药用必须回答的科学问题。因此,本论文将继续深入研究LysGH15,以揭示LysGH15重复应用之后,金葡菌是否能够产生针对其的耐药性,LysGH15进入体内后能否刺激机体产生抗体,所产生的抗体是否会对其体内的疗效产生不利影响;重复和大剂量应用该裂解酶是否会对机体造成损伤;通过免疫学鉴定法,深入研究该裂解酶在体内的药代动力学特性。为进一步的验证裂解酶LysGH15在治疗不同感染模型过程中的抗药性及免疫原性,本论文还对裂解酶LysGH15在治疗小鼠皮肤烧烫伤的效果进行了深入研究。首先,我们发现LysGH15在与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株重复作用之后,未引起金葡菌产生针对LysGH15的抗性,且每一代作用的菌株对LysGH15的敏感性没有变化。表明在实验期间,LysGH15不会诱导金葡菌产生抗性。进一步的体内研究表明,LysGH15可以刺激小鼠产生针对LysGH15的特异性抗体,在一次性应用后第三周抗体水平为(1:512),且主要为Ig G。将LysGH15多次重复免疫大白兔之后得到了高免血清,将血清中的抗体进行纯化。体外活性实验表明抗体不影响LysGH15对金黄色葡萄球菌的结合能力和裂解活性。进一步的体内治疗实验表明,当用LysGH15一次性免疫的小鼠抗体滴度达到最高时,单次静脉注射LysGH15(50μg)仍然可以有效地治疗被致死剂量感染的小鼠模型,治疗效果未受到影响。为了分析LysGH15在大鼠体内的药代动力学,本研究以制备并纯化的无标签LysGH15-165(CHAP片段)的兔源多克隆抗体为包被抗体,同时以HRP标记的抗HIS标签的单克隆抗体作为检测抗体,建立了一种灵敏的双抗体夹心方法。通过实验确定最后的包被抗体(LysGH15-165)与检测抗体(HRP-anti-HIS)的稀释比例为包被抗体(1:800)(3.2μg/m L),检测抗体(1:1600)(0.6μg/m L);以纯化后LysGH15蛋白为标准品对该方法进行了平行度、准确度(日内和日间变异)、稳定性的检测。实用工作范围约为0.6-300μg/m L,回收范围从91.2至100.53%,而日内和日间准确度的变异系数分别为≤8.31%和≤12.81%。当不同浓度的裂解酶溶液在-80℃反复冻存1次、2次及3次,其回收率会明显下降(40.87%-77.23%),但是当裂解酶保存在-80℃1个月、2个月以及4个月,其回收率在84.18%-101.61%,说明血浆样品(含有LysGH15)在-80℃放置4个月稳定,没有降解。并且也考察了主要的组织器官,心、肝、脾、肺、肾、胃、肠及肌肉注射点夹心酶联免疫吸附测定(Sandwich-ELISA)方法的准确度(日内和日间变异)、稳定性。本研究以尾静脉注射裂解酶LysGH15的方式,检测其在血液中的药代动力学参数,给予每只大鼠剂量12.5 mg/kg裂解酶及buffer,药物在血浆中的消除半衰期t1/2:mean=10.529 h;AUC(0-t):mean=320.164 mg/L*h;AUC(0-∞):mean=345.986 mg/L*h;达峰时间Tmax:mean=0.083h;最大血药浓度Cmax:mean=195.839 mg/L;平均滞留时间MRT为3.928 h;大鼠在每只给药剂量12.5 mg/kg裂解酶1h,LysGH15主要分布在血液、小肠、肾中,其中小肠的含量最大,在注射6h后,LysGH15主要分布在肾、胃、小肠内,在血液中的含量已经较小;给药24h后小肠、肾脏、胃中药物含量减少,但能检测到其存在。通过免疫组化实验进一步证明应用LysGH151h之后,即可在小肠、肾脏、胃检测到裂解酶;而6h后,在肾、肠和胃可以检测到较高的裂解酶的含量;24h后,药物在减少,但仍可以观测到。对裂解酶LysGH15进行了急性毒性及亚慢性毒性测定,在急性毒性试验中,通过腹腔一次性使用高剂量LysGH15(10 mg)并未发现动物机体有不适症状,主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠)也无病理变化。对雌雄大鼠腹腔注射并给予不同浓度剂量的LysGH15连续注射4周,其血液学指标和血生化指标均在标准范围内,说明长期注射LysGH15不会对机体产生毒性反应;且HE切片染色也未发现病理变化。为进一步的验证裂解酶LysGH15在治疗不同感染模型过程中的抗药性及免疫原性,本实验还建立了小鼠皮肤烧烫伤感染模型,并且评价了裂解酶LysGH15在体外烧烫伤模型中的治疗潜力。首先将LysGH15和中药单体芹菜素api加入到Aquaphor中以形成LAA软膏,LAA软膏同时表现出对金黄色葡萄球菌的杀菌活性和溶血抑制活性。在MRSA的小鼠皮肤感染模型中,LAA治疗组伤口皮肤中的细菌菌落计数在处理后18小时内约为102 CFU/mg(最终检测不到),而未治疗组的小鼠皮肤菌落计数约为106 CFU/mg。LAA软膏在治疗小鼠感染MRSA的皮肤模型中有效降低了促炎细胞因子的分泌、加速皮肤伤口愈合、促进伤口组织中巨噬细胞Ⅱ型相关标志物(精氨酸酶I和YM1)的转录水平。本研究为将LysGH15作为治疗耐药金葡菌感染的新型抗菌蛋白酶类药物提供坚实的理论与实验基础。
【关键词】:金黄色葡萄球菌 噬菌体 裂解酶 抗原性 药代动力学 皮肤感染
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.61
【目录】:
  • 摘要5-8
  • Abstract8-17
  • 英文缩写词表17-18
  • 前言18-20
  • 第一篇 文献综述20-44
  • 第一章 金黄色葡萄球菌概述20-22
  • 第二章 噬菌体及其疗法22-26
  • 2.1 噬菌体22-23
  • 2.2 噬菌体疗法23-26
  • 第三章 噬菌体裂解酶26-34
  • 3.1 裂解酶的结构26-28
  • 3.2 裂解酶的作用机制28
  • 3.3 裂解酶的免疫抗体28-30
  • 3.4 噬菌体裂解酶的相关应用30-32
  • 3.5 细菌对裂解酶的耐药性32-34
  • 第四章 药代动力学34-44
  • 4.1 蛋白多肽类药物药代动力学特征35-39
  • 4.1.1 给药途径35-36
  • 4.1.2 体内分布36-37
  • 4.1.3 代谢与消除37-39
  • 4.2 蛋白质类药物药代动力学研究方法39-44
  • 4.2.1 酶联免疫吸附测定(ELISA)40
  • 4.2.2 同位素标记示踪法40-41
  • 4.2.3 液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)41-42
  • 4.2.4 其他技术42-44
  • 第二篇 研究内容44-114
  • 第一章 裂解酶LysGH15的抗性与免疫原性的研究44-64
  • 1.1 实验材料45-47
  • 1.1.1 主要试剂45
  • 1.1.2 主要菌株和实验动物45
  • 1.1.3 主要仪器45-46
  • 1.1.4 主要试剂配制46-47
  • 1.2 实验方法47-51
  • 1.2.1 裂解酶LysGH15的表达与纯化47
  • 1.2.2 裂解酶LysGH15对MRSA及MSSA最小抑菌浓度(MIC)的检测47-48
  • 1.2.3 MRSA及MSSA对裂解酶产生抗性的检测48
  • 1.2.4 小鼠的一次性LysGH15免疫模型48
  • 1.2.5 ELISA检测48-49
  • 1.2.6 Western blot检测抗体的产生49-50
  • 1.2.7 抗体对LysGH15体外裂解活性影响的分析50
  • 1.2.8 抗体对LysGH15体外结合活性影响的分析50-51
  • 1.2.9 抗体对LysGH15体内治疗效果的影响51
  • 1.2.10 数据处理及统计学分析51
  • 1.3 结果51-62
  • 1.3.1 裂解酶LysGH15的表达与纯化51-52
  • 1.3.2 金黄色葡萄球菌对LysGH15产生抗性的检测52-54
  • 1.3.3 LysGH15免疫原性的研究54-55
  • 1.3.4 LysGH15与其抗体作用后裂解细菌的活性的检测55-57
  • 1.3.5 LysGH15的抗体对其体内治疗效果的评价57-59
  • 1.3.6 不同注射方式及剂量对裂解酶LysGH15治疗效果的评价.421.4 讨论59-62
  • 1.5 小结62-64
  • 第二章 裂解酶LysGH15双抗夹心ELISA方法的研究64-76
  • 2.1 实验材料65-66
  • 2.1.1 主要试剂65
  • 2.1.2 主要菌株和实验动物65
  • 2.1.3 主要仪器65
  • 2.1.4 主要试剂配制65-66
  • 2.2 实验方法66-68
  • 2.2.1 裂解酶LysGH15的表达与纯化66
  • 2.2.2 双抗夹心ELISA工作条件及程序的建立66-67
  • 2.2.3 双抗夹心ELISA标准曲线的绘制67
  • 2.2.4 建立方法准确度的测定67-68
  • 2.2.5 建立方法回收率的测定68
  • 2.2.6 建立方法稳定性的考察68
  • 2.2.7 数据处理及统计学分析68
  • 2.3 结果68-73
  • 2.3.1 包被抗体与检测抗体最佳工作浓度的确定:68-69
  • 2.3.2 检测方法标准曲线的绘制69-70
  • 2.3.3 检测方法准确度的检测70-72
  • 2.3.4 检测方法回收率的测定72-73
  • 2.3.5 检测方法稳定性的测定73
  • 2.4 讨论73-74
  • 2.5 小结74-76
  • 第三章 裂解酶LysGH15在大鼠体内药代动力学研究76-86
  • 3.1 实验材料76-78
  • 3.1.1 主要试剂76-77
  • 3.1.2 主要菌株和实验动物77
  • 3.1.3 主要仪器77
  • 3.1.4 主要试剂配制77-78
  • 3.2 实验方法78-80
  • 3.2.1 大鼠静脉给药药代动力学参数78
  • 3.2.2 取血方法和时间78
  • 3.2.3 大鼠组织分布实验78
  • 3.2.4 组织取样方法及时间78-79
  • 3.2.5 样品的测定79
  • 3.2.6 数据处理79-80
  • 3.3 实验结果80-84
  • 3.3.1 大鼠单次静脉注射给药后药代动力学参数80
  • 3.3.2 大鼠单次静脉给药LysGH15血药浓度-时间曲线80-81
  • 3.3.3 大鼠单次单次静脉给药LysGH15的药代动力学参数81-82
  • 3.3.4 大鼠单次单次静脉给药LysGH15后组织的分布82-84
  • 3.4 讨论84-85
  • 3.5 小结85-86
  • 第四章 裂解酶LysGH15急性及慢性毒性的研究86-98
  • 4.1 实验材料86-88
  • 4.1.1 主要试剂86
  • 4.1.2 主要菌株和实验动物86
  • 4.1.3 主要仪器86-87
  • 4.1.4 主要试剂配制87-88
  • 4.2 实验方法88-89
  • 4.2.1 急性毒性试验88
  • 4.2.2 慢性毒性试验88-89
  • 4.2.3 数据分析89
  • 4.3 结果89-95
  • 4.3.1 裂解酶对小鼠急性毒性试验89-91
  • 4.3.2 一般状况91
  • 4.3.3 体重变化情况91-92
  • 4.3.4 血液学指标变化情况92-93
  • 4.3.5 血生化指标变化情况93-94
  • 4.3.6 主要组织器官的病理变化94-95
  • 4.4 讨论95-96
  • 4.5 小结96-98
  • 第五章 裂解酶LysGH15在小鼠皮肤烧烫伤模型中的应用98-114
  • 5.1 实验材料99-101
  • 5.1.1 主要试剂99
  • 5.1.2 主要菌株和实验动物99
  • 5.1.3 主要仪器99-100
  • 5.1.4 主要试剂配制100-101
  • 5.2 实验方法101-104
  • 5.2.1 裂解酶LysGH15与芹菜素混合膏剂的制备101
  • 5.2.2 裂解酶与芹菜素混合膏剂(LysGH15-api)体外的裂解活性测定101-102
  • 5.2.3 扫描电镜观察102
  • 5.2.4 溶血实验102
  • 5.2.5 小鼠烧烫伤感染模型的建立102-103
  • 5.2.6 皮肤病理切片103
  • 5.2.7 qPCR检测皮肤组织巨噬细胞表面标志物103-104
  • 5.2.8 免疫原性的分析104
  • 5.2.9 数据处理及统计学分析104
  • 5.3 实验结果104-111
  • 5.3.1 LAA体外的裂解活性及溶血活性104-106
  • 5.3.2 LAA促进皮肤愈合106-109
  • 5.3.3 皮肤组织的H&E染色109
  • 5.3.4 LAA治疗后皮肤菌落数的检测109-111
  • 5.3.5 免疫原性的检测111
  • 5.4 讨论111-113
  • 5.5 小结113-114
  • 结论114-116
  • 创新点116-118
  • 参考文献118-134
  • 导师简介134-136
  • 作者简介136-138
  • 发表的学术论文138-140
  • 致谢140

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