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《黑龙江八一农垦大学》 2017年
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BRSV G蛋白单克隆抗体的制备及其DAS-ELISA方法的建立

李艳婷  
【摘要】:为建立检测牛呼吸道合胞体病毒DAS-ELISA方法,根据BRSV外膜糖蛋白G保守基因设计引物,构建重组克隆载体和重组表达载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,应用纯化的G蛋白作为抗原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠制备抗G蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体,利用单克隆抗体的高特异性及双抗体夹心的灵敏性建立检测BRSV的DAS-ELISA方法。G目的基因同GenbankTM(U24713)上发表的牛呼吸道合胞体病毒G基因核苷酸序列同源性为99.83%,氨基酸同源性为99.48%,目的蛋白为可溶性蛋白,大小为36 kDa,表达的G蛋白与BRSV抗体能很好地结合,具有良好的反应原性。重组BRSV-G/E.coli在IPTG最佳诱导浓度为1 mM且诱导5 h时目的蛋白表达量最高,洗脱液中咪唑浓度为200 mM时纯化效率最高,纯化后蛋白浓度为1.5 mg/mL左右。免疫动物后,获得了兔高免血清和5株能够稳定分泌抗G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E3、2B4、3F6、4B8、5F7,抗体亚类均为IgG1型,轻链均为κ链,杂交瘤细胞培养上清抗体效价分别为1∶2560、1∶640、1∶12800、1∶320、1∶640,腹水效价分别为1∶256000、1∶128000、1∶128000、1∶64000、1∶128000,以抗体效价较高且稳定性最好的1E3作为捕获抗体,多克隆抗体为检测抗体,方阵滴定试验确定捕获抗体1E3最佳工作浓度为2.5μg/mL,多克隆抗体最佳工作浓度为5μg/mL,并对其他反应条件作了进一步的优化,阴阳性临界值为0.239,批内和批间变异系数均小于10%,检测下限为1.43μg/mL,用建立的DAS-ELISA检测方法分别检测常引起牛呼吸道疾病的几种病原,只有牛呼吸道合胞体病毒发生特异性反应。DAS-ELISA和RT-PCR方法同时检测45份样品,敏感性、特异性、符合率分别92.0%、100%、95.6%。结果表明建立的DAS-ELISA检测方法快速、灵敏度高、特异性强,适用于临床样品大规模的检测,为BRSV疫情的监测和快速诊断奠定了基础。
【关键词】:牛呼吸道合胞体病毒 G蛋白 多克隆抗体 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA
【学位授予单位】:黑龙江八一农垦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 摘要10-11
  • 英文摘要11-12
  • 符号说明12-13
  • 第一章 文献综述13-25
  • 1.1 牛呼吸道合胞体病毒概述13-17
  • 1.2 流行病学17-19
  • 1.3 诊断方法19-21
  • 1.4 BRSV疫苗的研究进展21-22
  • 1.5 单克隆抗体研究进展22-23
  • 1.6 DAS-ELISA方法在检测病原中的应用23
  • 1.7 研究的目的与意义23-25
  • 第二章 牛呼吸道合胞体病毒G基因的原核表达25-41
  • 2.1 材料25-26
  • 2.2 方法26-32
  • 2.2.1 BRSV HJ株病毒液的活化26
  • 2.2.2 引物的设计与合成26-27
  • 2.2.3 BRSV病毒基因的提取27
  • 2.2.4 RT-PCR扩增27
  • 2.2.5 重组克隆质粒的构建及鉴定27-30
  • 2.2.6 重组表达质粒的构建及鉴定30
  • 2.2.7 目的基因在大肠杆菌中的表达30-31
  • 2.2.8 重组蛋白可溶性分析31
  • 2.2.9 重组蛋白的纯化31-32
  • 2.2.10 蛋白浓度测定32
  • 2.2.11 重组蛋白的Western blot鉴定32
  • 2.3 结果32-39
  • 2.3.1 BRSV病毒的增殖32
  • 2.3.2 BSRV G基因RT-PCR结果32-33
  • 2.3.3 重组克隆质粒的鉴定33-35
  • 2.3.4 重组表达质粒的鉴定35-36
  • 2.3.5 最佳诱导条件的确定36-37
  • 2.3.6 目的蛋白可溶性分析37-38
  • 2.3.7 目的蛋白的纯化38-39
  • 2.3.8 重组蛋白浓度鉴定39
  • 2.3.9 重组蛋白Western blot鉴定39
  • 2.4 讨论39-41
  • 第三章 牛呼吸道合胞体病毒G蛋白抗体的制备41-63
  • 3.1 材料41-42
  • 3.2 方法42-49
  • 3.2.1 兔免疫程序42-43
  • 3.2.2 多克隆抗体检测43-44
  • 3.2.3 多克隆抗体的纯化44
  • 3.2.4 多克隆抗体纯度的鉴定及其浓度的测定44-45
  • 3.2.5 杂交瘤细胞株的建立45-47
  • 3.2.6 杂交瘤细胞筛选和克隆化培养47
  • 3.2.7 杂交瘤细胞的冻存和复苏47-48
  • 3.2.8 杂交瘤细胞染色体分析48
  • 3.2.9 腹水的制备及纯化48
  • 3.2.10 单克隆抗体特异性检测48
  • 3.2.11 腹水效价及浓度的测定48-49
  • 3.3 结果49-59
  • 3.3.1 多克隆抗体检测49-51
  • 3.3.2 多克隆抗体的纯度鉴定及浓度测定结果51-52
  • 3.3.3 杂交瘤细胞株的建立结果52-54
  • 3.3.4 杂交瘤细胞的筛选和克隆化培养54-55
  • 3.3.5 细胞的冻存与复苏55
  • 3.3.6 杂交瘤细胞染色体分析55-56
  • 3.3.7 腹水纯化及浓度测定56-57
  • 3.3.8 单克隆抗体特异性检测57-59
  • 3.3.9 腹水效价检测59
  • 3.4 讨论59-63
  • 3.4.1 多克隆抗体制备59-60
  • 3.4.2 单克隆抗体制备60-63
  • 第四章 DAS-ELISA方法的建立63-77
  • 4.1 材料63
  • 4.2 方法63-65
  • 4.2.1 DAS-ELISA方法操作程序63
  • 4.2.2 DAS-ELISA反应条件的优化63-64
  • 4.2.3 临界值判定标准64-65
  • 4.2.4 特异性试验65
  • 4.2.5 重复性试验65
  • 4.2.6 灵敏性试验65
  • 4.2.7 DAS-ELISA与RT-PCR符合率试验65
  • 4.3 结果65-74
  • 4.3.1 DAS-ELISA方法的建立65-71
  • 4.3.2 临界值的确定71-72
  • 4.3.3 特异性试验结果72
  • 4.3.4 重复性试验结果72
  • 4.3.5 灵敏性试验结果72-73
  • 4.3.6 符合率试验73-74
  • 4.4 讨论74-77
  • 结论77-79
  • 参考文献79-89
  • 附录89-91
  • 致谢91-93
  • 个人简历93

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1 李艳婷;BRSV G蛋白单克隆抗体的制备及其DAS-ELISA方法的建立[D];黑龙江八一农垦大学;2017年
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