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《黑龙江八一农垦大学》 2017年
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苯乳酸生产菌株LY-78的乳酸脱氢酶基因克隆表达及酶学性质分析

李芬  
【摘要】:苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是在食品领域具备广泛利用价值的一种新型天然生物防腐剂,其突出特性为安全性高,性能稳定,抑菌谱广,不仅可以抑制细菌污染,还可抑制真菌污染,使食品货架期得以延长。本研究以PLA生产菌株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LY-78来源的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因为研究对象,通过对其全面的生物信息学分析,对具有生物活性的ldh基因构建重组工程菌,使LDH在重组工程菌中得到高效表达,分离纯化LDH测定其酶活力,并通过温度、p H以及金属离子等影响因素研究其酶学性质。1.乳酸脱氢酶基因的生物信息学分析。5个ldh基因的核苷酸序列及氨基酸序列均具有较高的保守性,均为位于细胞质的热稳定性、非分泌型和非跨膜蛋白,其中除L3-LDH由于缺失NAD+结合结构域和功能位点,可能不具有LDH活性外,D1-LDH、D2-LDH、L1-LDH和L2-LDH均具有完整的功能位点和结构域,均存在典型的NAD+结合位点基序GXGXXG,很可能具有真正的LDH活性。因此后续只进行ldh D1、ldh D2、ldh L1和ldh L2基因重组工程菌的构建。2.乳酸脱氢酶基因重组工程菌的构建。通过PCR技术获得ldh基因,对其进行克隆和亚克隆后,经双酶切及测序鉴定,结果表明成功构建了4个ldh基因重组工程菌;经SDS-PAGE鉴定,结果显示ldh D1、ldh D2、ldh L1以及ldh L2基因在重组工程菌中均高效表达;分别对高效表达的LDH产物分离纯化后,采用反相高效液相色谱法鉴定酶活,结果表明成功获得了具有催化苯丙酮酸产生PLA的D1-LDH、D2-LDH、L1-LDH以及L2-LDH,且其蛋白分子量依次约为37 k Da、35 k Da、34 k Da和33 k Da,与理论值相一致。3.重组乳酸脱氢酶酶学性质的分析。通过对酶活力的测定得出D1-LDH、D2-LDH、L1-LDH以及L2-LDH对苯丙酮酸比活力依次为65.35 U/mg、0.4123 U/mg、38.80 U/mg和0.1657 U/mg。结果表明植物乳杆菌LY-78中4个LDH中具有较高比活力的是D1-LDH与L1-LDH,对其酶学性质进一步探究表明:D1-LDH与L1-LDH对苯丙酮酸的最佳作用温度分别为30℃与40℃,最佳作用p H均为6.0,L1-LDH比D1-LDH具有更好的热稳定性和p H稳定性;Fe2+和Cu2+是D1-LDH和L1-LDH的抑制剂,而Mg2+和Mn2+是两者激活剂;在各自最适条件下测得D1-LDH和L1-LDH动力学常数依次Km为2.86 m M和3.77 m M,Vmax为1.272μmol/min和1.954μmol/min,Kcat为102 s~(-1)和219 s~(-1),Kcat/Km为36 m M~(-1)s~(-1)和58 m M~(-1)s~(-1)。结果表明D1-LDH对苯丙酮酸具有更强的亲和力,更有利于PLA的合成。综上所述,植物乳杆菌LY-78中4个LDH均具有催化还原苯丙酮酸生产PLA的能力,但是其酶活存在非常明显的差异,其中D1-LDH和L1-LDH对苯丙酮酸具有较高的酶活力,表明这2个酶在植物乳杆菌LY-78生物合成PLA途径中具有突出作用。
【学位授予单位】:黑龙江八一农垦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;TS202.3

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