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《东北农业大学》 2016年
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Tetherin和SAMHD1与马传染性贫血病毒相互作用的研究

姚秋成  
【摘要】:马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus,EIAV)与人获得性免疫缺陷病毒(HIV-1)同属于逆转录病毒科慢病毒属,是开展慢病毒致病和免疫机制研究的重要动物病毒模型。慢病毒引发的疾病,严重威胁动物和人类健康,其中以HIV-1感染人引发的艾滋病最为严重和受到关注。疫苗是防控传染病的重要手段,但慢病毒自身的抗原高度变异等特点,使其疫苗研究举步维艰。特别对于HIV-1疫苗的研究,尽管世界各国已投入巨大人力、物力,但仍未取得关键性突破。而在EIAV疫苗研究方面,二十世纪70年代,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的科研人员,通过马、驴体及体外细胞(驴白细胞、驴胎皮肤细胞)传代将EIAV强毒株驯化,成功获得EIAV弱毒株。实验室和现地应用证明,该弱毒株免疫马属动物后可诱导产生极强的免疫保护力。以该弱毒株作为疫苗在中国进行的大范围马属动物免疫接种,成功控制了EIA在中国的流行。而阐明该疫苗毒力弱化和诱导免疫保护的机制,有可能找到慢病毒诱导免疫保护的关键因素,为HIV疫苗研制提供参考。在探讨EIAV疫苗弱化和诱导免疫保护机制的过程中,一个重要的科学问题是,为何通过异种动物或者体外细胞传代会导致病毒致弱?长期以来科学界并未对该现象给出明确的机制阐述。已有研究表明,病毒侵入宿主会诱发宿主细胞产生强烈的先天性免疫反应和继发性免疫反应。同时,在宿主细胞内存在着许多天然免疫因子,当病毒入侵时它们可以迅速反应,直接或间接作用于病毒以抑制病毒的复制和传播,进而保护宿主抵御病毒感染。目前,研究比较广泛的宿主天然免疫限制因子有APOBEC3家族、TRIM家族、Tetherin/BST2、SAMHD1、MOV10等。这些限制因子可在病毒复制过程中的各阶段通过各种不同机制直接或间接作用于病毒,抑制病毒的复制和传播。EIAV弱毒疫苗的毒力弱化,主要发生在体外细胞的传代培养过程中。由于该过程缺少宿主特异性免疫应答的作用,推测宿主天然免疫应答特别是细胞天然免疫限制因子可能在病毒毒力减弱过程中发挥重要作用。为验证上述假设,本研究选择Tetherin和SAMHD1两种限制因子,通过评价它们与EIAV的相互作用,寻找这两种分子在EIAV致弱过程中的作用。本研究首先通过序列分析、蛋白结构分析、细胞定位分析、蛋白表达分析、细胞转染、Western Blotting实验技术等方法比较了马、驴Tetherin的基本生物学功能及抗病毒能力。实验结果表明,马Tetherin与驴Tetherin的氨基酸序列、分子拓扑结构、细胞定位及高级分子结构都非常相似,但二者存在个别氨基酸位点的变异,且这些氨基酸变异导致驴Tetherin限制EIAV病毒出芽的能力稍强于马Tetherin。进而又通过蛋白-蛋白相互作用等分子生物学实验,评价了驴Tetherin与不同进化程度的EIAV毒株的相互作用。实验结果显示,驴Tetherin在限制不同进化程度的EIAV毒株出芽的能力存在差异,病毒毒力越弱,Tetherin的限制作用越强;EIAV强弱毒的Env基因具有一定的差异,但其均可拮抗驴Tetherin的限制作用,这种拮抗作用随病毒的致弱而变弱。在此基础上,本研究对SAMHD1与EIAV的相互作用进行了研究。先将人、马SAMHD1进行对比分析,并通过建立能稳定表达马SAMHD1基因的U937细胞系作为感染模型,然后将三质粒系统包装的假病毒(HIV-1、SIV、EIAV)感染上述构建成功的稳定表达马SAMHD1基因的U937细胞系,以评价马SAMHD1的抗病毒能力。实验结果显示,马SAMHD1具有与人SAMHD1相似的氨基酸序列及结构,且具有广谱抗逆转录病毒的作用,而HD结构域是其发挥抗病毒功能的主要功能域。最后,通过蛋白-蛋白相互作用等实验方法验证了EIAV与马SAMHD1的相互作用。实验结果表明,EIAV可通过其自身编码的Rev蛋白拮抗马SAMHD1。且不同毒株的Rev拮抗马SAMHD1的能力不同,即EIAV-Rev-LN拮抗马SAMHD1的能力强于其他EIAV株Rev,提示EIAV-Rev拮抗马SAMHD1的作用具有种属差异,但EIAV-Rev拮抗马SAMHD1的具体机制尚不清楚。本研究以中国EIAV弱毒系统为研究模型,首次对异体/顿感宿主感染传代致弱病原的发生机制进行研究,从宿主天然免疫限制因子与病原相互作用角度,探讨病原毒力弱化的原因。研究结果确证了我们提出的实验假设的科学性,其在深入挖掘天然免疫限制因子抗逆转录病毒作用机制和拓展其作用意义的基础上,有助于阐明慢病毒的致病和免疫机制,促进慢病毒免疫防治领域相关研究的开展。
【关键词】:EIAV 进化 天然免疫限制因子 Tetherin SAMHD1
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 摘要8-10
  • Abstract10-13
  • 1 前言13-27
  • 1.1 EIAV概述13-18
  • 1.1.1 慢病毒属的构成13-14
  • 1.1.2 EIAV的认知及分类地位14
  • 1.1.3 EIAV的形态结构及理化特征14-15
  • 1.1.4 EIAV的致病性15
  • 1.1.5 EIAV基因组结构及其编码蛋白15-17
  • 1.1.6 EIAV弱毒疫苗的研制17-18
  • 1.2 天然免疫限制因子研究进展18-26
  • 1.2.1 宿主天然免疫限制因子Tetherin20-22
  • 1.2.2 宿主天然免疫限制因子SAMHD122-26
  • 1.3 研究目的与意义26-27
  • 2 材料与方法27-36
  • 2.1 主要材料27-30
  • 2.1.1 细胞与病毒27
  • 2.1.2 质粒与菌株27-28
  • 2.1.3 主要试剂与耗材28-29
  • 2.1.4 主要仪器29-30
  • 2.1.5 试剂配制30
  • 2.2 实验方法30-36
  • 2.2.1 真核表达质粒的构建30-32
  • 2.2.2 细胞转染32
  • 2.2.3 Western Blotting32
  • 2.2.4 荧光素酶报告基因检测及逆转录酶活性检测32-33
  • 2.2.5 荧光定量RT-PCR33-34
  • 2.2.6 激光共聚焦34
  • 2.2.7 免疫共沉淀34
  • 2.2.8 表达SAMHD1基因的U937细胞系的构建34
  • 2.2.9 流式细胞技术34-35
  • 2.2.10 数据分析及处理35-36
  • 3 结果与分析36-58
  • 3.1 Tetherin在EIAV弱毒疫苗致弱过程中的作用研究36-46
  • 3.1.1 马、驴限制因子Tetherin抗病毒能力的比较和分析36-41
  • 3.1.2 Tetherin在病毒进化中的作用41-46
  • 3.2 马SAMHD1与EIAV相互作用的研究46-58
  • 3.2.1 马SAMHD1的抗病毒作用研究46-50
  • 3.2.2 EIAV对马SAMHD1的拮抗作用研究50-58
  • 4 讨论58-63
  • 4.1 Tetherin在EIAV弱毒疫苗致弱过程中的作用58-60
  • 4.2 SAMHD1与EIAV的相互作用60-63
  • 5 结论63-64
  • 致谢64-65
  • 参考文献65-82
  • 附录82-84
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文84

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