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《东北农业大学》 2016年
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冷诱导解除银腺杨(P.alba×P.glandulosa)休眠过程中茎部形成层的蛋白质组学研究

金峰  
【摘要】:植物的维管形成层组织是木本植物区别于其它一年生或多年生草本植物的主要特征,木本植物之所以粗壮高大是因为其茎部存在可以不断分化成新的木质部以及韧皮部的形成层组织。休眠是一种植物体或其器官在某一时期生长和代谢暂停活动的生理现象,树木可以通过休眠这一重要的机制来适应季节的变化。然而,我们对休眠的维持和解除的生理机制仍然知之甚少。由于全基因组测序的完成,杨树作为林木的模式物种被广泛研究并应用。因此,在本研究中,我们以杨树形成层为研究对象,采用半薄切片技术、同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术和LC-MS/MS技术联合使用的方法对低温及光周期诱导的杨树形成层在休眠与休眠解除之间的变化进行分析,以期通过植物解剖学、组织化学染色、蛋白质组学海量的数据以及组成的代谢网络更好地了解树木休眠维持和解除的调控机制,为林木育种提供夯实的理论基础。半薄切片的研究结果显示,在休眠期,形成层细胞排列紧密,体积较小,层数减少,细胞内含有大量的储藏物质;而当休眠解除恢复到活动期时,形成层细胞体积变大,层数增加,细胞内的储藏物质逐渐消失。iTRAQ蛋白质组学的研究结果显示,在杨树形成层中共鉴定到3789个差异蛋白,其中有2298个蛋白在休眠期到活动期发生显著地变化。生物信息学分析结果显示,大部分鉴定到的差异蛋白参与能量代谢、信号转导、植物激素、抗逆与氧化还原、细胞壁和次生代谢等代谢途径。其中,在休眠维持和解除的过程中,参与能量代谢的蛋白质变化显著;在低温诱导到休眠解除的过程中,与植物激素相关的蛋白质变化显著;同时,在由休眠期到活动期过渡的过程中,参与次生代谢以及细胞壁代谢的蛋白质也表现出不同的表达模式。组织化学染色的结果表明,脂质代谢相关的蛋白在生理休眠和被动休眠期解除阶段都发生了显著的变化,而碳水化合物代谢相关的蛋白,变化主要发生在被动休眠期解除阶段。这两类提供能量的物质在变化趋势上大体相同,但在不同阶段的变化上又存在着各自的变化过程,说明在这两类代谢途径其作用的重点可能不同。利用QRT-PCR对一组能量代谢相关的差异显著的蛋白进行了基因表达水平上的验证,对iTRAQ得到的蛋白质组学的结果进行确认。组织化学染色的结果更进一步的验证了休眠解除过程中能量代谢物质,包括糖,淀粉,脂类的变化趋势,从不同方面肯定了蛋白质组学的结果。所有这些实验结果可以帮助我们更好的了解休眠解除这一生理学过程,并对以后的研究提供了更多的理论依据和思路。
【关键词】:杨树 形成层 休眠解除 蛋白质组学 iTRAQ 组织化学染色
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S792.11
【目录】:
  • 摘要8-10
  • 英文摘要10-12
  • 1 前言12-28
  • 1.1 维管形成层12-16
  • 1.1.1 维管形成层的起源12-13
  • 1.1.2 维管形成层的结构13-14
  • 1.1.3 维管形成层季节性活动式样14-16
  • 1.1.4 杨树维管形成层16
  • 1.2 植物休眠的建立与解除16-23
  • 1.2.1 休眠的建立16-17
  • 1.2.2 休眠的维持17-18
  • 1.2.3 休眠的解除18-23
  • 1.3 蛋白质组学的研究23-25
  • 1.3.1 蛋白质组学的起源及发展23
  • 1.3.2 蛋白质组学研究的技术手段23-25
  • 1.4 林木的蛋白质组研究进展25-26
  • 1.5 本研究的理论依据和研究意义26-28
  • 2 材料与方法28-38
  • 2.1 实验材料28-30
  • 2.1.1 材料的培养28-29
  • 2.1.2 材料的获取29-30
  • 2.2 实验试剂及仪器30-31
  • 2.2.1 实验试剂30-31
  • 2.2.2 实验仪器31
  • 2.3 实验方法31-38
  • 2.3.1 低温诱导解除杨树休眠实验体系32
  • 2.3.2 银腺杨形成层总蛋白的提取32-33
  • 2.3.3 蛋白浓度的检测33
  • 2.3.4 SDS电泳33
  • 2.3.5 蛋白质酶解33-34
  • 2.3.6 iTRAQ标记34
  • 2.3.7 SCX分离34
  • 2.3.8 基于QE的液质联用分析34-35
  • 2.3.9 解剖和组织化学观察35
  • 2.3.10 数据分析35-36
  • 2.3.11 QRT-PCR验证36-38
  • 3 结果38-84
  • 3.1 银腺杨形成层休眠解除期间的显微观察38-39
  • 3.2 蛋白质组学前期的实验结果39-84
  • 3.2.1 蛋白质的提取及检测39-40
  • 3.2.2 iTRAQ标记样本40
  • 3.2.3 蛋白质鉴定的参数选择40-41
  • 3.2.4 蛋白质鉴定的数据采集及质量评估41
  • 3.2.5 蛋白质鉴定的基本信息41-42
  • 3.2.6 蛋白质定量信息统计42-44
  • 3.2.7 蛋白质GO注释44-48
  • 3.2.8 差异蛋白代谢通路的分析48-84
  • 4 讨论84-88
  • 4.1 形成层休眠解除过程中与能量代谢途径相关的蛋白84-85
  • 4.2 形成层休眠解除过程中与次生代谢途径相关的蛋白85-86
  • 4.3 形成层休眠解除过程中与细胞壁,逆境和氧化还原途径的相关蛋白86
  • 4.4 形成层休眠解除过程中与信号转导和激素途径相关的蛋白86-88
  • 5 结论88-90
  • 致谢90-92
  • 参考文献92-99
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文99

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1 金峰;冷诱导解除银腺杨(P.alba×P.glandulosa)休眠过程中茎部形成层的蛋白质组学研究[D];东北农业大学;2016年
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