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《东北农业大学》 2016年
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大豆miR172及靶基因参与开花诱导和逆境响应的功能分析

王涛  
【摘要】:大豆最初起源于我国,距今已有5000多年历史,目前在世界范围内均有广泛栽培。大豆所提供的植物蛋白和油分可以满足人们的大部分需求,是重要的粮油兼用作物,因此大豆逐渐成为了各个国家农业生产中不可或缺的重要组成。大豆对光照等自然条件比较敏感,因此大豆品种的跨区域种植受到限制,进而影响大豆的总体面积和产量。干旱、盐碱等非生物胁迫会在大豆生长的各个时期对其造成威胁,进而引起作物产量的大幅度降低。为了扩大我国大豆的种植区域,改善大豆品种的适应性,进而增加大豆产量,首先要降低大豆开花对光的敏感性,使其在大部分区域都能够正常开花,成熟;更要提高大豆品种在逆境胁迫下的抵抗能力,使其在相对恶劣的环境下也能保持稳产甚至高产。micro RNA(miRNA)是动植物体内广泛存在的一种不具有编码功能的小分子RNA,一般只有20~24个核苷酸大小。不同于传统的基因,miRNA的功能主要是通过引起靶基因m RNA的降解或者阻碍靶基因mRNA的翻译,进而导致靶基因的功能受到抑制。最近的研究显示,miRNA不但在植物的生长发育和形态发生等过程中发挥了重要的作用,而且广泛参与了植物对环境胁迫响应的应答过程。miR172是一个保守的miRNA家族,在许多植物中已经得到报道与研究。大部分研究已经证实miR172在植物花期确定和花器官形成方面的重要作用。AP2-like基因家族作为开花时间调控的抑制因子,已经被证实是miR172的靶基因。近期的研究发现miR172可能在植物应答环境胁迫的过程中发挥了作用。小麦的miR172可以被渗透胁迫、盐及低温所诱导,而在水稻中,干旱则可以明显降低miR172的表达。本研究利用实时定量PCR技术以东农42为试验材料,分析了大豆gma-miR172a及其靶基因Glyma03g33470的时空特异性表达情况。通过gma-miR172a转基因拟南芥、toe1恢复拟南芥分析验证其在植物开花诱导中的作用。同时,我们同样利用实时定量PCR的方法分析了东农50大豆中gma-miR172c及其靶基因Glyma01g39520在PEG、Na Cl以及脱落酸处理下的表达模式,通过gma-miR172c在模式植物拟南芥中过量表达,对转基因植株进行逆境胁迫处理和基因表达分析,揭示了大豆gma-miR172c在植物逆境响应中的基本功能,主要结果如下:1.Real-time RT-PCR分析表明,gma-miR172a的表达水平会随着大豆的生长发育而提高,在营养生长末期,花芽形成初期达到峰值;gma-miR172a的表达具有组织特异性。2.5’RACE实验表明gma-miR172a在体内可以直接切割Glyma03g33470;Real-time RT-PCR分析表明Glyma03g33470的表达也具有时空特异性。3.利用p CAMBIA3301-gma-miR172a载体转化拟南芥,经PPT筛选、PCR和实时定量PCR检测获得纯合的T3代gma-miR172a转基因拟南芥株系;利用p CAMBIA3301-r Glyma03g33470载体转化toe1拟南芥突变体,经PPT筛选、PCR和实时定量PCR检测获得T3代toe1恢复拟南芥株系。4.过表达gma-miR172a拟南芥表现为花期提前、叶片数减少,toe1突变体恢复拟南芥花期介于野生型和toe1突变体之间。实时定量PCR结果表明,gma-miR172a可以通过提高FT、AP1和LFY的表达从而使转基因拟南芥早花。5.Real-time RT-PCR分析表明Gm GIa过表达大豆体内gma-miR172a的成熟序列、Gm DCL1和Gm SE的表达水平高于东农50大豆,证实GI可以通过参与大豆miR172a的成熟过程影响其丰度。6.Real time RT-PCR分析表明gma-miR172c可以被脱落酸(ABA)、干旱和Na Cl诱导表达。7.5’RACE实验表明gma-miR172c在大豆体内可以直接切割Glyma01g39520;Real-time RT-PCR分析表明Glyma01g39520的表达也受ABA、干旱和Na Cl的影响。8.利用p CAMBIA3301-gma-miR172c载体转化拟南芥,经PPT筛选、PCR和实时定量PCR检测获得纯合的T3代gma-miR172c转基因拟南芥株系;利用p CAMBIA3301-r Glyma01g39520载体转化snz突变体,经PPT筛选、PCR和实时定量PCR检测获得T3代snz/35S::r Glyma01g39520拟南芥株系。9.在拟南芥中,过表达gma-miR172c提高了植株在干旱和盐胁迫下的萌发率、子叶绿化率、根长和存活情况。同时,gma-miR172c过表达拟南芥对外源ABA更加敏感。gma-miR172c转基因株系离体叶片水分丧失较慢。而且,过表达gma-miR172c株系中胁迫应答基因的转录水平、SOD酶活性和脯氨酸含量显著提高。以上结果表明,gma-miR172c在拟南芥对干旱和盐胁迫的响应中是一个正调控因子。10.经表型分析发现gma-miR172c过表达拟南芥在干旱胁迫下开花提前明显。11.snz/35S::r Glyma01g39520拟南芥在干旱、脱落酸胁迫下的生长表型介于野生型和snz突变体之间,表明Glyma01g39520可以部分削弱snz突变体的胁迫抗性,在逆境胁迫响应中发挥了一定作用。
【关键词】:大豆 miR172 开花诱导 非生物逆境胁迫 拟南芥
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S565.1
【目录】:
  • 摘要10-12
  • 英文摘要12-15
  • 1 前言15-29
  • 1.1 miRNA的发现与定义15
  • 1.2 miRNA的生物合成与作用机制15-18
  • 1.2.1 miRNA的生物合成15-17
  • 1.2.2 miRNA的作用机制17-18
  • 1.3 植物miRNA表达和活动的调控18-20
  • 1.3.1 转录调控19
  • 1.3.2 miRNA加工和活动的调节19-20
  • 1.3.3 将miRNA整合到特定的AGO复合体中20
  • 1.4 植物miRNA靶基因的识别和鉴定20-21
  • 1.5 植物体内miRNA的功能21-27
  • 1.5.1 miRNA在调控植物生长发育中的作用21-23
  • 1.5.2 miRNA在植物激素调节与信号转导中的作用23-24
  • 1.5.3 miRNA在植物对生物胁迫响应中的作用24-25
  • 1.5.4 miRNA在植物对非生物胁迫响应中的作用25-26
  • 1.5.5 miRNA调节自身和si RNA的合成和功能26-27
  • 1.6 大豆miRNA研究进展27-28
  • 1.7 本研究的目的与意义28-29
  • 2 材料与方法29-55
  • 2.1 实验材料29-30
  • 2.1.1 植物材料29
  • 2.1.2 菌种及载体29
  • 2.1.3 主要试剂29
  • 2.1.4 数据库及生物软件29-30
  • 2.2 实验方法30-55
  • 2.2.1 gma-miR172及其靶基因的序列比对和分析30
  • 2.2.2 大豆材料处理30-31
  • 2.2.3 RNA提取31
  • 2.2.4 除去RNA抽提物中的基因组DNA31
  • 2.2.5 荧光实时定量PCR31-35
  • 2.2.6 gma-miR172介导的靶基因精确切割位点的 5’RACE分析35-39
  • 2.2.7 gma-miR172a前体的克隆及表达载体的构建39-42
  • 2.2.8 gma-miR172c前体的克隆及表达载体的构建42
  • 2.2.9 突变gma-miR172a靶位点r Glyma03g33470的植物表达载体构建42-44
  • 2.2.10 突变gma-miR172c靶位点r Glyma01g39520的植物表达载体构建44
  • 2.2.11 拟南芥突变体的筛选44-45
  • 2.2.12 农杆菌介导法侵染拟南芥花序45-46
  • 2.2.13 转基因拟南芥的分子生物学检测46
  • 2.2.14 gma-miR172a转基因拟南芥的日长处理46-47
  • 2.2.15 过表达Glyma03g33470的toe1突变体恢复拟南芥的日长处理47
  • 2.2.16 gma-miR172c转基因拟南芥的逆境胁迫处理47-52
  • 2.2.17 转基因拟南芥逆境处理下的开花分析52-53
  • 2.2.18 过表达Glyma01g39520的snz突变体拟南芥的逆境处理53-54
  • 2.2.19 统计分析54-55
  • 3 结果与分析55-95
  • 3.1 gma-miR172a参与植物开花诱导的研究55-70
  • 3.1.1 大豆miR172成员序列比对分析55-56
  • 3.1.2 gma-miR172的表达模式分析56-58
  • 3.1.3 gma-miR172a靶基因的预测验证及序列分析58-60
  • 3.1.4 靶基因Glyma03g33470的表达模式分析60-62
  • 3.1.5 植物过量表达载体的构建62-63
  • 3.1.6 gma-miR172a转基因拟南芥的抗性筛选及检测63-65
  • 3.1.7 过表达gma-miR172a拟南芥的开花表型65-67
  • 3.1.8 过表达Glyma03g33470的toe1恢复拟南芥的开花表型67-69
  • 3.1.9 大豆GI基因调控gma-miR172a的加工过程69-70
  • 3.2 gma-miR172c参与植物逆境胁迫响应的研究70-95
  • 3.2.1 gma-miR172的启动子元件与表达模式分析70-72
  • 3.2.2 gma-miR172c靶基因的 5’RACE验证72-73
  • 3.2.3 Glyma01g39520逆境胁迫下的表达模式分析73-74
  • 3.2.4 gma-miR172c转基因拟南芥的抗性筛选及检测74-76
  • 3.2.5 干旱处理过表达gma-miR172c拟南芥表型分析76-79
  • 3.2.6 盐处理过表达gma-miR172c拟南芥表型分析79-82
  • 3.2.7 过表达gma-miR172c拟南芥对ABA的敏感性82-84
  • 3.2.8 过表达gma-miR172c拟南芥体内胁迫相关生理指标变化情况84-86
  • 3.2.9 干旱胁迫下过表达gma-miR172c拟南芥体内基因表达分析86-87
  • 3.2.10 过表达gma-miR172c拟南芥逆境胁迫下的开花表型87-89
  • 3.2.11 过表达Glyma01g39520的snz拟南芥的逆境胁迫响应89-95
  • 4 讨论95-101
  • 4.1 gma-miR172a调控植物的开花时间95-96
  • 4.2 gma-miR172c调控植物的逆境胁迫响应能力96-101
  • 5 结论101-102
  • 致谢102-103
  • 参考文献103-120
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文120

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