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《华东理工大学》 2017年
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Acinetobacter sp.LMB-5的固定化及在DBP诱导下的差异蛋白质组学研究

王晶  
【摘要】:邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类异型有机生物质的总称,作为主要的环境污染物和激素干扰物广泛存在于各种日常消费品中。由于PAEs与聚合物以较弱的非共价键相连,很容易从塑料制品迁移至环境中,对人和动物的健康造成威胁。研究表明,微生物降解是治理环境中PAEs污染物的有效途径。然而,当游离的微生物直接用于环境修复时,往往面临着活力损失和难以重复利用等问题。相对于游离细胞,固定化细胞既能充分利用微生物降解的高效性,又可以使高效降解菌免受不利环境因素的侵害。Acinetobacter sp.LMB-5能通过共代谢的方式高效降解PAEs污染物,本研究以磁性纳米粒子为基础设计了一种细胞固定化方法。通过水热法合成了 230 nm的Fe_3O_4纳米粒子并在表面修饰了氨基基团。结果显示该Fe_3O_4@NH2纳米粒子分散性良好,能够在LMB-5表面牢牢固定,且通过外加磁场可分离回收。通过对固定化细胞的降解特性进行研究,发现其与游离细胞降解能力相当,可以在72 h内完全降解100 mg/L的邻苯二甲酸丁酯(DBP)。但与游离细胞相比,固定化细胞对温度、pH变化和重金属离子污染表现出更强的适应性和容忍性。并且该固定化细胞在重复使用5个循环后仍有近80%的DBP降解活性。为了进一步对DBP在LMB-5中的代谢途径进行分析,通过二甲基标记的定量蛋白质组学对LMB-5在DBP诱导下的全蛋白表达水平进行了系统的研究。结果显示,共鉴定到2163个蛋白,其中可定量蛋白1716个,1.5倍显著上调蛋白188个。对显著上调蛋白进行生物信息学分析,发现它们主要参与氨基酸代谢、异性生物质降解和生物应激反应等代谢途径。结合基因组学对PAEs降解相关酶进行预测,共得到双加氧酶10个,脱氢酶14个,脱羧酶3个。通过以上研究为PAEs降解相关酶的筛选提供了理论依据。
【关键词】:邻苯二甲酸酯 Acinetobacter sp.LMB-5 Fe_3O_4@NH_2纳米粒子 固定化细胞 定量蛋白质组学
【学位授予单位】:华东理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:X172;X592
【目录】:
  • 摘要5-6
  • Abstract6-11
  • 第1章 绪论11-24
  • 1.1 邻苯二甲酸酯概述11-13
  • 1.1.1 邻苯二甲酸酯简介11-12
  • 1.1.2 邻苯二甲酸酯的健康危害12
  • 1.1.3 邻苯二甲酸酯对环境的污染12-13
  • 1.1.4 邻苯二甲酸酯的生物降解13
  • 1.2 固定化微生物降解环境污染物13-16
  • 1.2.1 固定化微生物技术简介13-14
  • 1.2.2 固定化载体的选择14-15
  • 1.2.3 固定化微生物降解环境污染物研究进展15-16
  • 1.3 磁性纳米粒子在固定化技术中的应用16-20
  • 1.3.1 磁性纳米粒子简介16
  • 1.3.2 磁性纳米粒子的制备方法16-18
  • 1.3.3 磁性纳米粒子在固定化技术中的应用研究进展18-20
  • 1.4 基于质谱的蛋白质组学概述20-23
  • 1.4.1 基于质谱的蛋白质组学简介20
  • 1.4.2 蛋白的相对定量方法20-23
  • 1.5 研究目的与意义23-24
  • 第2章 磁性纳米粒子固定化Acinetobacter sp. LMB-5的研究24-39
  • 2.1 引言24
  • 2.2 试剂与仪器24-26
  • 2.2.1 实验试剂24
  • 2.2.2 实验仪器24-25
  • 2.2.3 常用培养基及溶液配方25-26
  • 2.3 实验方法26-30
  • 2.3.1 磁性纳米粒子的合成及修饰26-27
  • 2.3.2 菌株的培养及固定化27-28
  • 2.3.3 细胞干重的测定方法28
  • 2.3.4 TEM样品前处理28
  • 2.3.5 DBP含量的测定28-29
  • 2.3.6 考察固定化细胞的降解特性29
  • 2.3.7 固定化细胞的代谢途径研究29
  • 2.3.8 固定化细胞重复使用率的测定29-30
  • 2.4 实验结果与分析30-37
  • 2.4.1 磁性纳米粒子的特性表征30-32
  • 2.4.2 固定化细胞的特性表征32-33
  • 2.4.3 固定化细胞的DBP降解特性33-35
  • 2.4.4 磁性纳米粒子对菌体代谢途径的影响35-37
  • 2.4.5 固定化细胞的重复使用率37
  • 2.5 本章小结37-39
  • 第3章 Acinetobacter sp. LMB-5在DBP诱导下的差异蛋白质组学研究.39-55
  • 3.1 引言39
  • 3.2 试剂与仪器39-40
  • 3.2.1 实验试剂39-40
  • 3.2.2 实验仪器40
  • 3.2.3 常用培养基及配方40
  • 3.3 实验方法40-43
  • 3.3.1 菌株的培养40-41
  • 3.3.2 菌体总蛋白的提取41
  • 3.3.3 蛋白的酶切41
  • 3.3.4 肽段的脱盐41-42
  • 3.3.5 肽段的二甲基标记42
  • 3.3.6 多肽的HPLC分离与合并42
  • 3.3.7 nano HPLC/MS/MS分析及参数设置42-43
  • 3.3.8 质谱数据分析43
  • 3.3.9 生物信息学分析43
  • 3.4 结果与分析43-54
  • 3.4.1 蛋白的鉴定43-44
  • 3.4.2 生物信息学分析44-47
  • 3.4.3 邻苯二甲酸酯降解相关酶的预测47-50
  • 3.4.4 邻苯二甲酸降解基因簇的预测50-51
  • 3.4.5 原儿茶酸降解基因簇的预测51-52
  • 3.4.6 其他基因簇52-54
  • 3.5 本章小结54-55
  • 第4章 总结与展望55-57
  • 参考文献57-66
  • 致谢66-68
  • 附录一68-69
  • 附录二69-74
  • 附录三74-75

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