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《江苏师范大学》 2017年
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苏北海岸带典型盐生植物根际放线菌多样性及其耐盐促生作用研究

白娟娈  
【摘要】:本研究以江苏省连云港海岸带7种典型盐生植物根际土壤为材料,利用纯培养的方法总共分离得到45株放线菌,并在纯培养分离的基础上,利用免培养技术对盐生植物根际土壤放线菌多样性进行了研究,并对分离的菌株进行16S rRNA基因测序、系统发育分析以及潜在促生活性检测。根据根际放线菌促生潜在性检测,筛选出2株放线菌进行了盆栽实验,研究盐胁迫下根际土壤放线菌对小麦生长的影响。菌株16S rRNA基因测序结果显示,可培养的放线菌分别属于链霉菌属(Streptomyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、戈登氏菌属(Gordonia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、微杆菌属(Microbacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、壤霉菌属(Agromyces)、微球菌属(Micrococcus)、原小单孢菌属(Promicromonospora)、野野村氏菌属(Nonomuraea)、小单孢菌属(Micromonospora)12个属。通过Miseq PE300平台对7份根际土壤样品中细菌16S rRNA基因的高变异区V5-V7区进行测序,共获得有效序列138541条,共6641个OTU。通过与数据库进行比对分析,7份根际土壤中共探测到66个放线菌属,其中分枝杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)和节杆菌属(Arthrabacter)最为丰富。高通量测序结果与我们纯培养分离的结果基本一致,但盐生植物根际土壤中还存在大量未培养的放线菌类群。通过对菌株KLBMP S0027和KLBMP S0039的形态特征观察、生理生化特征、化学分类、16S rRNA与gyrB基因系统发育分析以及DNA-DNA分子杂交的多相分类学研究,证实了2株菌属于诺卡氏菌属的新物种,KLBMP S0027和KLBMP S0039分别命名为江苏诺卡氏菌(Nocardia jiangsuensis sp.nov.),根际栖居诺卡氏菌(Nocardia rhizosphaerihabitans sp.nov.)。对分离得到的放线菌进行解磷、固氮、产吲哚乙酸(IAA)、产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)、产铁载体等潜在促生长特性,以及产淀粉酶、木聚糖酶和几丁质酶等酶活性和耐受NaCl能力检测,研究结果发现分离的菌株至少有一种甚至多种促生潜在特征。以菌株KLBMP S0051和KLBMP S0019为材料,通过盐胁迫下接种土壤放线菌对小麦种子萌发及生长的影响初步探究了盐胁迫下两株菌对小麦的促生效应。研究结果发现,盐胁迫下接种菌株KLBMP S0051和KLBMP S0019后分别提高了小麦种子的萌发率1.41和1.98倍,并用KLBMP S0019菌悬液浸种的小麦继续盆栽试验,2%的盐胁迫下发现菌株KLBMP S0019能显著促进小麦植株的生长。本研究对海岸带盐生植物根际土壤的微生物组进行了分析,发现盐生植物根际土壤蕴含着丰富的放线菌资源和促生功能菌株,结合盆栽实验初步探究了盐胁迫下盐生植物根际放线菌对小麦幼苗的促生作用。本研究为后续深入探究盐生植物根际放线菌的生态功能提供了良好的前期基础与材料。
【关键词】:盐生植物 放线菌 高通量测序 多样性 多相分类 促生效应
【学位授予单位】:江苏师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S154.3
【目录】:
  • 摘要4-6
  • Abstract6-11
  • 1 引言11-21
  • 1.1 选题背景和意义11-13
  • 1.1.1 江苏海岸带现状分析11
  • 1.1.2 土壤盐渍化的危害11-12
  • 1.1.3 盐生植物12-13
  • 1.2 放线菌的研究概况13-15
  • 1.3 植物根际土壤细菌多样性的研究方法15-16
  • 1.3.1 纯培养方法15
  • 1.3.2 免培养方法15-16
  • 1.4 植物根际促生菌的促生作用16-19
  • 1.4.1 固氮作用17
  • 1.4.2 溶磷作用17
  • 1.4.3 产IAA17-18
  • 1.4.4 ACC脱氨酶18
  • 1.4.5 产生铁载体18-19
  • 1.4.6 产生抗病原菌的水解酶19
  • 1.5 本论文研究目的与意义19
  • 1.6 本研究方法与内容19-20
  • 1.7 研究技术路线20-21
  • 2 盐生植物根际土壤放线菌多样性分析21-41
  • 2.1 材料与方法21-25
  • 2.1.1 主要设备21-22
  • 2.1.2 实验样品的采集22
  • 2.1.3 培养基的配制22
  • 2.1.4 土壤样品的预处理22-23
  • 2.1.5 土壤放线菌的纯化与保藏23
  • 2.1.6 基因组DNA的提取23
  • 2.1.7 16S rRNA基因PCR扩增23-24
  • 2.1.8 构建分离菌株的系统发育树24
  • 2.1.9 高通量测序结果分析24-25
  • 2.1.10 数据分析25
  • 2.2 结果与讨论25-39
  • 2.2.1 盐生植物根际土壤纯培养分离结果25-31
  • 2.2.2 盐生植物根际土壤免培养测序结果31-39
  • 2.3 本章小结39-41
  • 3 潜在新物种的多相分类研究41-67
  • 3.1 实验与材料41-46
  • 3.1.1 试验菌株及所用仪器41
  • 3.1.2 形态特征鉴定41-42
  • 3.1.3 生理生化特征鉴定42-43
  • 3.1.4 化学分类试验43-45
  • 3.1.5 分子系统学试验45-46
  • 3.2 结果与讨论46-64
  • 3.2.1 诺卡氏菌属菌株KLBMP S0027T的多相分类研究46-55
  • 3.2.2 诺卡氏菌属菌株KLBMP S0039T的多相分类研究55-64
  • 3.3 本章小结64-67
  • 4 菌株促生长特征评价67-87
  • 4.1 材料与方法67-72
  • 4.1.1 主要仪器67
  • 4.1.2 实验材料67
  • 4.1.3 解磷作用67-68
  • 4.1.4 固氮作用68
  • 4.1.5 纤维素酶活性检测68
  • 4.1.6 木聚糖酶活性检测68
  • 4.1.7 淀粉酶活性检测68
  • 4.1.8 产氨活性检测68-69
  • 4.1.9 蛋白酶活性检测69
  • 4.1.10 菌株耐盐性检测69
  • 4.1.11 产铁载体活性检测69
  • 4.1.12 几丁质酶活性检测69
  • 4.1.13 菌株产植物生长激素(IAA)活性检测69-70
  • 4.1.14 菌株产ACC脱氨酶活性检测70-71
  • 4.1.15 盆栽实验71-72
  • 4.1.16 数据测量与统计72
  • 4.2 结果与分析72-85
  • 4.2.1 菌株促生潜在活性检测72-82
  • 4.2.2 菌株对小麦促生效果的初步评价82-85
  • 4.3 本章小结85-87
  • 5 总结展望87-89
  • 附录89-95
  • 参考文献95-103
  • 致谢103-105
  • 作者简历105-107
  • 学位论文数据集107

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