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《浙江大学》 2017年
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PET分子影像监测神经干细胞治疗颞叶癫痫的实验研究

杜瑞莉  
【摘要】:目的癫痫是一种常见的神经系统疾病,以反复的自发发作为特征,严重危害患者身心健康。目前癫痫的主要治疗方法是手术和药物治疗,但约有30%癫痫病人对于抗癫痫药物治疗无效,被认为是难治性癫痫。目前,手术切除致痫灶是治疗难治性癫痫的首选方法,但手术可带来创伤引起偏瘫、偏盲、记忆损害等。其中,颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)是难治性癫痫中最常见的类型,采用药物及手术治疗都难以达到根治并修复致痫灶的效果。因此,探索新的方法用于治疗TLE,是临床治疗的迫切需要。随着干细胞技术的不断完善,干细胞以其独特的优势在再生医学研究中展现出巨大的治疗潜能。神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)是一类可多向分化成中枢神经系统各种类型的细胞,已逐步被用于神经系统疾病的临床前实验研究。诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通过转基因技术加入特定的转录因子,将人/动物体细胞重新编程为具有多向分化潜能的干细胞。iPSCs可具有多种分化潜能,且不受伦理、免疫排斥等诸多方面的限制,因此在神经系统疾病也有一定发展潜力。本研究采用NSCs和iPSCs移植方法,利用大鼠TLE浙江大学博士学位论文 中文摘要模型,应用18F-FDG小动物正电子发射计算机断层显像(micro positron emission tomography,micro-PET)联合视频脑电(video-electroencephalography,Video-EEG),时空动态的共同监测比较移植后干细胞治疗TLE的功能代谢改善情况,可望为临床TLE干细胞治疗提供指导。方法通过在海马区立体定向注射红藻氨酸(kainicacid,KA)建立TLE大鼠模型,将28只雄性SD大鼠随机分为4组(每组7只):NSCs治疗组、iPSCs治疗组、癫痫对照(E-CTR)组和正常对照(CTR)组。在模型建立成功后的24h及干细胞移植后1、3、5、6周分别行Video-EEG及连续的18F-FDGmicro-PET监测。最后一次PET扫描结束后,将所有大鼠灌注取脑并行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、免疫组织化学及免疫荧光分析。选取的指标如下:神经元特异性核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、r-氨基丁酸(gamma amino butyric acid,GABA)、神经肽 Y(neuropeptideY,NPY)和葡萄糖转运蛋白 1(GlucoseTransporter1,GLUT-1)。结果Video-EEG监测发现:干细胞治疗后,在第3、5、6周,NSCs和iPSCs治疗组癫痫发作频率均明显低于E-CTR组(p0.05);NSCs组的癫痫发作频率在第5周时明显低于iPSCs组(p0.05);iPSCs组和NSCs组的癫痫持续时间在第6周时均明显低于E-CTR组(p0.05)。18F-FDG PET结果分析:在第3周时,NSCs和iPSCs治疗组的18F-FDG摄取值均明显高于E-CTR组(P0.05),NSCs组高于iPSCs组,但无统计学差异;NSCs组的18F-FDG摄取值在第5周时显著高于其它三组(P值均小于0.05)且在第6周时显著高于E-CTR组(P0.05)。浙江大学博士学位论文 中文摘要HE染色结果显示:NSCs组双侧CA1区的神经元数量明显高于E-CTR组(P0.05),iPSCs组右侧CA1区神经元数量明显高于E-CTR组(P0.05)。左侧CA3区NSCs组和iPSCs组神经元数量均明显高于E-CTR组(P0.05)。免疫组织化学及免疫荧光检查证实移植的NSCs和iPSCs在脑内存活、定植并分化为NeuN、GFAP、GABA、NPY 和 GLUT-1。此外,E-CTR组右侧海马CA1区18F-FDG摄取值与GFAP(P=0.037)呈显著正相关,与GLUT-1(P = 0.021)呈显著负相关。结论18F-FDGmicro-PET、VEEG、免疫组化和免疫荧光的联合研究证实,NSCs和iPSCs移植后能够促进癫痫大鼠脑损伤区的代谢和功能恢复。与iPSCs相比,NSCs移植降低癫痫的发作频率,更能促进癫痫大鼠脑葡萄糖代谢的恢复。
【关键词】:正电子发射型计算机断层(PET) 颞叶癫痫(TLE) 诱导多功能干细胞(iPSCs) 神经干细胞(NSCs) 反复出现的痫性发作(SRSs)
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R742.1;R817.4
【目录】:
  • 致谢5-7
  • 中文摘要7-10
  • 英文摘要10-13
  • 缩写词13-17
  • 1 前言17-22
  • 2 材料与方法22-45
  • 2.1 主要仪器及器械22-24
  • 2.2 主要试剂24-25
  • 2.3 实验流程25-26
  • 2.4 MEF细胞培养26-28
  • 2.5 IPSCS细胞培养28-31
  • 2.6 NSCS细胞培养31-34
  • 2.7 癍痫动物模型的制备34-37
  • 2.8 干细胞移植37-38
  • 2.9 大鼠MRI、MICRO-PET扫描及图像处理38-40
  • 2.10 灌注取脑40-41
  • 2.11 免疫组织化学及免疫荧光41-43
  • 2.12 结果判断和分析43-44
  • 2.13 统计学分析44-45
  • 3 结果45-68
  • 3.1 细胞形态45-46
  • 3.2 行为学结果46-48
  • 3.3 MICRO-PET结果48-51
  • 3.4 免疫组织化学和免疫荧光结果51-66
  • 3.5 相关性分析66-68
  • 4 讨论68-73
  • 5 结论73-74
  • 参考文献74-85
  • 综述85-108
  • 参考文献97-108
  • 作者简历108

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