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《浙江工业大学》 2015年
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葡萄糖异构酶的固定化及其性能研究

郭东京  
【摘要】:葡萄糖异构酶又称木糖异构酶,是工业上生产高果糖浆的关键酶。高果糖浆在食品、饮料、医药等行业均有广泛的应用,是现代人们追求健康生活的理想糖源。根据果糖含量(42%,55%,90%)的不同,高果糖浆可分成三种类型,42型、55型和90型。食品和饮料中常用的是55型的高果糖浆,但该类型高果糖浆通常是经42型高果糖浆浓缩分离所得,而不能由葡萄糖异构酶直接转化获得。若通过酶的改造直接得到55%的高果糖浆,则可省略费用昂贵的浓缩步骤,同时研究一种适合于改造酶的固定化方法将具有非常重要的现实意义。本论文利用实验室构建的菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TEGI,对其所产的在85℃条件下能实现葡萄糖液55%转化的葡萄糖异构酶进行固定化研究。本论文首先研究了戊二醛交联法固定葡萄糖异构酶,并制备成适合填充床上连续转化使用的颗粒。首先考察了不同细胞状态(全细胞和部分破碎细胞)对交联效果和稳定性的影响,结果表明,细胞不经破碎,可以直接交联固定,利用破碎的细胞进行固定虽然酶活收率有所下降,但相应的操作稳定性会有所提高。同时考察了交联后的凝胶冻存处理和不冻存处理对固定化酶活力、稳定性和固定化酶成型的影响,结果表明交联后的凝胶冻存后对活力有很大的提高,对稳定性的影响不大。冷冻处理后凝胶疏松的结构给颗粒成型增加了难度。其次,考察了交联过程添加絮凝剂对固定效果的影响,分别选择加入壳聚糖和聚乙烯亚胺两种,结果表明加入聚乙烯亚胺和戊二醛交联固定效果较佳。进一步对该法的固定化条件进行优化,结果表明:在室温下,以聚乙烯亚胺浓度为2%(v/v),戊二醛浓度为0.5%(v/v),硅藻土0.6%(w/v),固定pH为6.0,缓冲液为Na_2HPO_4-NaH_2PO_4,固定时间1.5-2 h时,效果最佳,酶活收率在80-90%。最后,研究了聚乙烯亚胺-戊二醛交联固定化细胞制备高果糖浆的催化特性。结果表明:固定化酶和游离酶的最适温度和pH都相同,分别为85℃和7.0。此外,考察不同温度和pH条件下固定化葡萄糖异构酶的稳定性发现,温度为80℃,pH为7.5时固定化葡萄糖异构酶的稳定性较好。金属离子Mg~(2+),Fe~(2+),Zn~(2+),Mn~(2+)和Co~(2+)可以提高固定化酶的催化活性和稳定性,而Ba~(2+),Ni~(2+),Ca~(2+)和Cu~(2+)的添加则将降低酶活和稳定性。最高转化率为53.96%,反应三批后趋于稳定,反应10批后固定化葡萄糖异构酶仍有90%的初始酶活,转化率在46.70%以上。室温下保存23 d,活力基本保持不变。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q814.2;TS201.25

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