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《中国科学技术大学》 2017年
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埃博拉病毒VP35与抑制剂、碳纳米管和dsRNA作用模式及机理的分子动力学模拟研究

张艳军  
【摘要】:埃博拉病毒(EBOVs)通常会引起严重的出血热症状,如果不进行有效的治疗一般会有很高的致死率,到目前为止还没有有效的治疗手段。具有多种功能的埃博拉病毒蛋白VP35在病毒的转录复制和对人体的免疫逃逸中起着至关重要的作用,因此VP35被认为是药物设计和开发的潜在靶点。但传统的实验手段对埃博拉病毒VP35与配体以及其免疫逃逸机制的微观机理的研究具有一定的局限性。本文利用分子动力学(MD)模拟的方法对VP35干扰素抑制域(VP35ⅡD)与潜在的小分子抑制剂吡咯烷酮类化合物GA017、碳纳米管和dsRNA的结合模式以及作用机理进行了研究。(1)VP35 ⅡD与GA017结合模式及作用机理的分子动力学模拟研究VP35ⅡD第一功能区(FBP)可以与埃博拉病毒核蛋白结合,在病毒的转录复制中起着重要的作用。在这项研究中,我们用全原子分子动力学模拟的方法以及MM/GBSA能量分解的方法对野生型(WT),单突变型(K248A,K251A和I295A)和双突变型(K248A/I295A)与GA017的结合模式及作用机理进行了研究。模拟结果表明与GA017的结合使VP35 ⅡD的结构更加稳定,同时使VP35第一功能区(FBP)的口袋空间减小。计算结果还说明了静电相互作用和范德华相互作用在VP35与GA017结合过程中起着主要作用。I295A单突变和K248A/I295A双突变对VP35第一功能区的结构具有很大的影响,1295A的突变致使氨基酸R300-G301-D302形成一个新的螺旋,而K248A/I295A双突变导致氨基酸V294-I295-H296-I297形成的折叠消失。此外,结合能的计算表明I295A和K248A/I295A突变致使与GA017的结合能降低,而K248A和K251A突变使结合能有所升高。我们得到的研究结果与实验结果具有较好的一致性,K248A/I295A双突变基本上会导致VP35与小分子结合失败。这里的实验结果对日后进一步设计对抗埃博拉病毒的小分子抑制剂具有一定的指导意义。(2)碳纳米管与VP35 ⅡD结合模式及作用机理的分子对接及分子动力学模拟研究碳纳米管具有很多相对于其他材料非常独特的性质,引起了人们对其大量的研究,并且应经成功应用于很多领域。同时,纳米管也被发现在药物输运和作为抑制剂方面具有巨大的研究价值。本文利用分子对接的方法研究了不同长度不同直径的单壁碳纳米管(SWCNT)与VP35 ⅡD的对接,然后从中选取22个构象进行全原子分子动力学模拟,来研究不同尺寸纳米管对蛋白结构的影响以及纳米管的最佳结合构象,之后用全原子分子动力学模拟和MM/GBSA自由能计算的方法研究了 SWCNT与WT和突变型(K248A、I295A和K248A/I295A)之间的结合模式和作用机理。分子对接和分子动力学模拟结果表明随着纳米管长度和直径的增大,对蛋白质结构的稳定性也产生了较大的影响,像VS7-a体系中,碳纳米管插入到蛋白质的二级结构中,对蛋白的空间结构产生了严重的破坏,再如VS10-b体系中碳纳米管的作用致使残基305-309形成的α螺旋与残基238-252形成的αα螺旋远离,使得蛋白整体结构变得松散不稳定。通过对各个体系结合自由能的分析,我们发现随着碳纳米管长度的增长结合自由能也随之增加,但是当纳米管长度增加到一定长度后,结合能基本上就不再增加了,而碳纳米管直径的变化不会对结合能产生太大的影响,但会对蛋白结构稳定性产生不利影响。相对于 WT-SWCNT 体系,突变体系 K248A-SWCNT、I295A-SWCNT 和 K248A/I295A-SWCNT的结合自由能都有所降低,但是并不太显著。说明关键残基突变在一定程度上会影响到SWCNT与VP35 ⅡD的结合,但是影响并不太明显。此外,SWCNT在与VP35 ⅡD结合过程中,范德华相互作用起着决定性的作用。该研究结果可以为纳米管对蛋白毒性的研究提供理论上的参考。(3)VP35 ⅡD与dsRNA的相互作用及识别机制的分子动力学模拟研究VP35ⅡD中央功能区(CBP)可以识别并竞争性结合可以激活人体对病毒免疫反应的双链RNA(dsRNA)骨架和末端,从而实现病毒对人体的免疫逃逸。选择性突变VP35 ⅡD CBP保守残基可以使VP35 ⅡD丧失对dsRNA结合活性,从而削弱EBOV以VP35ⅡD为基础的干扰素抑制。在这里,我们用全原子分子动力学模拟和结合自由能分析的方法并结合对VP35 ⅡDCBP的保守氨基酸进行突变来研究VP35 ⅡD CBP与dsRNA的微观作用机理,以期找出废除VP35 ⅡD能识别和结合dsRNA的关键点。通过对达到平衡后的VP35ⅡD与dsRNA复合物结构进行分析,我们发现残基R312A/R322A双突变会导致dsRNA与VP35 ⅡD的结合位点以及取向与WT-dsRNA完全不同,也就是说R312A/R322A双突变会导致VP35 ⅡD失去结合dsRNA的功能。结合自由能的计算表明残基R312A,R322A和K339A单突变会使VP35 ⅡD与dsRNA的结合自由能分别降低17.82,13.18和13.68kcal/mol。自由能分解表明关键残基较大的结合能贡献主要来源于较强的静电相互作用,分析得出这主要是因为关键残基(R312,R322和K339)带有正电的侧链与带有负电的dsRNA骨架相互作用导致。R312A,R322A和K339A单突变虽然对VP35 ⅡDCBP的结构没有太大的影响,但是这些残基的突变破坏了体系氢键网络和CBP表面静电势的分布,从而很大程度上改变了 R312,R322等残基对结合自由能的静电相互作用的贡献。模拟结果表明VP35ⅡDCBP端帽氨基酸主要作用是识别dsRNA末端,其与dsRNA的作用主要是范德华相互作用,而CBP内的关键保守残基R312,R322和K339可以通过其侧链与dsRNA骨架较强的静电相互作用使得dsRNA固定于CBP中,在dsRNA结合中起着至关重要的作用。
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373;TB383.1

【参考文献】
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