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《中国科学技术大学》 2017年
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蓖麻毒素A链和核糖体蛋白P2相互作用的研究及金黄色葡萄球菌中Rot和SaeR~(DBD)的结构生物学研究

范晓娇  
【摘要】:核糖体失活蛋白(RIPs)是一种N-糖苷酶,可以将28SrRNA上一个保守的腺嘌呤脱嘌呤而导致核糖体失活,抑制蛋白质的合成。蓖麻毒素(Ricin)是从蓖麻种子中分离出的一种毒素,属于II型RIPs。Ricin的A链(RTA)是一个32 KD并具有RNAN-糖苷酶活性的亚基。RTA可以将28S rRNAsarcin-ricine loop(SRL)上一个保守的腺嘌呤移除使核糖体失活。人源stalk蛋白复合物是一个五聚体,包含一个P0和两个P-P2异二聚体。核糖体stalk蛋白C端的11个氨基酸残基(SDDDMGFGLFD)高度保守,除了招募延伸因子,还和RIPs相互作用。有研究证实RTA也和stalk蛋白C端保守的11个氨基酸残基相互作用,但详细的分子机制还不清楚。在本研究中,我们通过1TC实验确定了 RTA和人源核糖体stalk蛋白P2的相互作用,并且确定RTA主要识别P2高度保守的C端。解析了1.50 A RTA和P2 C端小肽复合物(RTA-C10-P2)的晶体结构。从结构中观察到,C10-P2主要插入到RTA的一个疏水口袋中。Pull-down实验证明了 RTA和C10-P2相互作用界面的关键氨基酸残基。体外抑制蛋白质翻译实验进一步证明了 RTA和stalk蛋白的相互作用对于RTA抑制核糖体合成蛋白质是必须的。将RTA-C10-P2复合物结构与天花粉蛋白(TCS)和P蛋白C端复合物(TCS-C11-P)结构进行比较,发现虽然C端小肽结合RTA或TCS的构象不同,但C端保守的LF花样在和RTA或TCS结合中起到至关重要的作用。进一步的分析发现LF花样在真核生物和古细菌的核糖体stalk蛋白中是高度保守的,同时也是翻译因子结合核糖体必须的元件,这些结果表明RTA、TCS以及翻译因子都是通过疏水相互作用和高度保守的LF花样相互作用。金黄色葡萄球菌是一种重要的人类病原菌,可以引起肺炎、心内膜炎、败血症等多种疾病,尤其是甲氧西林抗性、万古霉素抗性菌株的出现,使这些疾病更加复杂。这些疾病的多样性和严重性主要依赖于金黄色葡萄球菌中大量毒力因子的表达。毒力因子的表达和分泌是由一系列的调控因子严格调控的。SarA是金黄色葡萄球菌中一种全局性的转录调控因子。SarA蛋白家族至少有11个成员,可以直接和目的基因的启动子区结合从而调控多种毒力因子的转录。Rot属于SarA蛋白家族中的单结构域亚家族,它可以影响168种基因的转录。由于缺乏Rot的结构信息,Rot和目的基因启动子区结合模式的细节还不清楚。在本研究中,我们解析了 1.77 A Rot蛋白的晶体结构,结构表明一个不对称单位中有两个Rot分子,且形成了一个同源二聚体。每个Rot单体都有一个螺旋-转角-螺旋花样和β-发夹花样,组成经典的翼状螺旋花样。荧光偏振实验结果表明Rot优先识别约30个碱基的AT-rich dsDNA。体内外实验证明了 Rot翼状螺旋花样上的正电荷氨基酸残基对于Rot识别dsDNA起到非常重要的作用。因此,我们推测Rot和SarA、SarR以及SarS具有相似的识别dsDNA的模式,都是由螺旋-转角-螺旋花样和dsDNA的大沟结合,β-发夹花样和dsDNA的小沟结合。分子筛层析和荧光偏振实验证明Rot是以二体的形式作为最小的功能单位结合dsDNA的。此外,我们发现Rot和其他SarA同源物的二体作用模式明显不同,而这种差异暗示Rot具有不同于其他蛋白的转录调节机制。双组份调节系统(TCS)是细菌、低等真核生物以及植物监测环境调节并作出反应的一种信号转导机制。金黄色葡萄球菌中有16种保守的TCSs。SaeR/S是其中的一种TCS,该TCS在一些分泌蛋白、细胞壁蛋白以及细胞壁相关蛋白等毒力因子的表达中起着关键的作用。SaeR属于反应调控因子OmpR/PhoB亚家族,它包含一个N端的接收结构域(RD)和一个C端的结合DNA的结构域(DBD)。虽然已经确定SaeR是通过DBD区域和目的基因启动子区结合,但是详细的分子机制还不清楚。在本研究中,我们解析了 2.50 A SaeRDBD蛋白的晶体结构。从结构中观察到SaeRDBD以单体的形式存在且具有一个螺旋-转角-螺旋花样和β-发夹花样,组成经典的翼状螺旋花样。分子筛层析实验表明SaeR和SaeRDBD都以单体的形式存在于溶液中。EMSA实验表明SaeR和SaeRDBD都可以结合P1启动子,但SaeR具有更强的dsDNA亲和力。体内外实验证明了翼状螺旋花样上的5个氨基酸残基对于SaeR体外结合P1启动子和体内发挥生理功能的重要性。因此,我们推测SaeRDBD和PhoBDBD具有相似的识别dsDNA的模式,都是由螺旋-转角-螺旋花样和dsDNA的大沟结合,β-发夹花样和dsDNA的小沟结合。
【关键词】:核糖体失活蛋白 蓖麻毒素 RTA 核糖体蛋白P2 金黄色葡萄球菌 SarA蛋白家族 Rot 双组份调节系统 SaeR/S SaeR
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;R378.11
【目录】:
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-16
  • 第一篇 蓖麻毒素A链和核糖体蛋白P2相互作用的研究16-90
  • 第1章 综述16-28
  • 1.1 核糖体失活蛋白简介16-19
  • 1.2 核糖体失活蛋白ricin19-22
  • 1.3 核糖体stalk蛋白22-23
  • 1.4 核糖体失活蛋白和核糖体stalk蛋白相互作用的研究23-24
  • 1.5 Ricin和核糖体stalk蛋白相互作用的研究现状24-28
  • 第2章 实验过程28-64
  • 2.1 基因克隆及质粒构建28-31
  • 2.1.1 基因克隆28-29
  • 2.1.2 PCR片段的回收29
  • 2.1.3 酶切和连接反应29-30
  • 2.1.4 连接产物的转化30
  • 2.1.5 抽提质粒与阳性克隆的鉴定30
  • 2.1.6 突变体质粒的构建30-31
  • 2.2 重组蛋白的表达及纯化31-33
  • 2.2.1 重组蛋白的表达31
  • 2.2.2 重组蛋白的纯化31-33
  • 2.3 晶体的生长33-34
  • 2.4 衍射数据的收集及处理34-39
  • 2.4.1 衍射数据的收集34-35
  • 2.4.2 衍射数据的处理35-39
  • 2.5 结构解析和模型修正39-46
  • 2.5.1 结构解析和初步修正39-42
  • 2.5.2 占有率的调整42-43
  • 2.5.3 各向异性温度因子修正43-44
  • 2.5.4 双重构象修正44-46
  • 2.6 结构模型的质量分析46-60
  • 2.6.1 结构模型与电子密度轮廓的吻合情况46-47
  • 2.6.2 结构模型的温度因子分析47-48
  • 2.6.3 结构模型的实空间相关系数分析48-49
  • 2.6.4 结构模型的立体化学分析49-50
  • 2.6.5 不同分辨率结构模型参数的比较50-53
  • 2.6.6 结构模型中分子的比较53-56
  • 2.6.7 各向异性温度因子修正对结构模型的影响56-60
  • 2.7 Pull-down实验60-61
  • 2.8 等温滴定微量热实验61
  • 2.9 RTA抑制核糖体合成蛋白质活性的测定61
  • 2.10 圆二色谱分析61-64
  • 第3章 实验结果与讨论64-79
  • 3.1 整体结构64-65
  • 3.2 Linker对结构的影响65-66
  • 3.3 晶体堆积对结构的影响66-68
  • 3.4 RTA和C10-P2相互作用界面的分析68-73
  • 3.5 RTA与P2相互作用界面影响RTA抑制核糖体合成蛋白质的活性73-74
  • 3.6 DDDM花样对RTA和C10-P2相互作用界面的影响74
  • 3.7 RTA与TCS识别P蛋白模型的比较74-79
  • 本篇小结79-81
  • 参考文献81-90
  • 第二篇 金黄色葡萄球菌中毒性调控因子Rot的结构生物学研究90-160
  • 第4章 综述90-98
  • 4.1 金黄色葡萄球菌简介90-92
  • 4.2 SarA及其家族蛋白92-95
  • 4.3 Rot调控因子95-98
  • 第5章 实验过程98-142
  • 5.1 基因克隆及质粒构建98-100
  • 5.1.1 基因克隆98
  • 5.1.2 PCR片段的回收98-99
  • 5.1.3 酶切和连接反应99
  • 5.1.4 连接产物的转化99
  • 5.1.5 抽提质粒与阳性克隆的鉴定99
  • 5.1.6 突变体质粒的构建99-100
  • 5.2 重组蛋白的表达及纯化100-103
  • 5.2.1 重组蛋白的表达100-101
  • 5.2.2 重组蛋白的纯化101-103
  • 5.3 晶体的生长103-104
  • 5.3.1 Rot native蛋白晶体的生长103-104
  • 5.3.2 Rot硒代蛋白晶体的生长104
  • 5.4 衍射数据的收集及处理104-113
  • 5.4.1 衍射数据的收集104-106
  • 5.4.2 衍射数据的处理106-113
  • 5.5 结构解析和模型修正113-119
  • 5.5.1 结构解析和初步修正113-116
  • 5.5.2 占有率的调整116-117
  • 5.5.3 电子密度缺陷区域模型的修正117-119
  • 5.6 结构模型的质量分析119-133
  • 5.6.1 结构模型与电子密度轮廓的吻合情况119-120
  • 5.6.2 结构模型的温度因子分析120-122
  • 5.6.3 结构模型的实空间相关系数分析122
  • 5.6.4 结构模型的立体化学分析122-124
  • 5.6.5 不同分辨率结构模型参数的比较124-127
  • 5.6.6 结构模型中Rot的比较127-133
  • 5.7 Rot-dsDNA复合物的尝试133-139
  • 5.7.1 晶体的生长及衍射数据的收集133-136
  • 5.7.2 衍射数据的处理136-138
  • 5.7.3 结构初步解析及分析138-139
  • 5.8 荧光偏振分析139-140
  • 5.9 分子排阻层析140
  • 5.10 Rot敲除菌株的回补及western blot检测140-142
  • 第6章 实验结果与讨论142-154
  • 6.1 整体结构142-143
  • 6.2 Rot结合dsDNA的特性143-144
  • 6.3 Rot结合dsDNA的作用界面分析144-146
  • 6.4 Rot二体作用界面的分析146-148
  • 6.5 Rot对α-toxm表达的抑制作用分析148
  • 6.6 Rot与SarA家族蛋白的比较148-154
  • 6.6.1 Rot与SarA家族蛋白序列的比较148-149
  • 6.6.2 Rot与SarA家族蛋白的结构比较149-154
  • 本篇小结154-155
  • 参考文献155-160
  • 第三篇 金黄色葡萄球菌中SaeR~(DBD)的结构生物学研究160-214
  • 第7章 综述160-164
  • 7.1 双组份调节系统160-161
  • 7.2 SaeR/S双组份调节系统161-162
  • 7.3 SaeR转录调控因子162-164
  • 第8章 实验过程164-198
  • 8.1 基因克隆及质粒构建164-166
  • 8.1.1 基因克隆164-165
  • 8.1.2 PCR片段的回收165
  • 8.1.3 酶切和连接反应165
  • 8.1.4 连接产物的转化165-166
  • 8.1.5 抽提质粒与阳性克隆的鉴定166
  • 8.1.6 突变体质粒的构建166
  • 8.2 重组蛋白的表达及纯化166-170
  • 8.2.1 重组蛋白的表达166-167
  • 8.2.2 重组蛋白的纯化167-170
  • 8.3 晶体的生长170-172
  • 8.4 衍射数据的收集及处理172-177
  • 8.4.1 衍射数据的收集172-173
  • 8.4.2 衍射数据的处理173-177
  • 8.5 结构解析和模型修正177-181
  • 8.5.1 初步解析和修正177-179
  • 8.5.2 占有率调整179-181
  • 8.6 结构模型的质量分析181-195
  • 8.6.1 结构模型与电子密度轮廓的吻合情况181-182
  • 8.6.2 结构模型的温度因子分析182-183
  • 8.6.3 结构模型的实空间相关系数分析183
  • 8.6.4 结构模型的立体化学分析183-185
  • 8.6.5 不同分辨率结构模型参数的比较185-191
  • 8.6.6 结构模型中SaeR~(DBD)的比较191-195
  • 8.7 凝胶迁移分析195-196
  • 8.8 圆二色谱分析196
  • 8.9 分子排阻层析196
  • 8.10 SaeR敲除菌株的回补及α-toxin的检测196-198
  • 第9章 实验结果与讨论198-208
  • 9.1 SaeR~(DBD)整体结构198-199
  • 9.2 SaeR和SaeR~(DBD)结合dsDNA特性的分析199-201
  • 9.3 SaeR和dsDNA相互作用界面的分析201-203
  • 9.4 SaeR正调控α-toxin的表达203-204
  • 9.5 SaeR~(DBD)识别dsDNA可能的机制204-208
  • 本篇小结208-209
  • 参考文献209-214
  • 附录214-430
  • 致谢430-432
  • 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果432

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