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《中国科学技术大学》 2017年
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金黄色葡萄球菌临床菌株中Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统的鉴定与功能研究

曹林艳  
【摘要】:金黄色葡萄球菌是人类重要的病原细菌,可引起多种感染性疾病。面对来自宿主和环境的压力,金黄色葡萄球菌不断地进化以提高自身的适应能力,从而抵抗真核宿主的免疫系统及环境中的杀菌因素。其适应环境的主要方式之一是通过水平基因转移获取可移动遗传元件如质粒、转座子及噬菌体之上的毒力和抗生素抗性相关基因。原核生物中成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats[CRISPR]-CRISPR associated proteins[Cas])组成CRISPR-Cas系统,具有特异性靶向入侵核酸的功能,其靶标主要是噬菌体和质粒等可移动元件。目前为止,国外有几个金黄色葡萄球菌临床菌株被发现含有Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统,但没有相关的功能研究报道。在金黄色葡萄球菌的近亲表皮葡萄球菌RP62a中,其Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统的免疫功能已经得到验证。此外,有研究发现一些Ⅰ型和Ⅱ型系统还参与了细菌的生理和毒力调控过程。国内金黄色葡萄球菌临床菌株中CRISPR-Cas系统的分布情况,其免疫功能及其他生理调节功能,在本研究之前都未见报道。本论文主要进行了三个方面的工作:首先,我们根据三个已报道CRISPR-Cas系统的序列设计了针对四个cas基因用于PCR筛选的简并引物。最终我们从六百多个临床菌株中得到6个含Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统的金黄色葡萄球菌临床菌株,并随后对这六个菌送样进行了全基因组二代重测序。其中5个新筛选菌株与已报道菌株有相似的CR]ISPR序列,但MLST,spa分型显示它们在种系发生上距离较远。这说明CRISPR-Cas系统可以在菌株间进行水平转移,而不仅仅通过垂直遗传的方式进行传播。在已报道菌株和新发现的5个MRSA菌株中,CRISPR-Cas系统都与SCCmec邻近,这提示CRISPR-Cas系统的整合位点可能在基因组上SCCmec插入位置的附近。对CRISPR序列的分析发现,葡萄球菌中Ⅲ-A型系统的重复序列(repeat)具有高度保守性,而间隔序列(spacer)的同源序列大部分发现于噬菌体中裂解区的模板链上。此外,对六个菌株的比较发现,spacer数量较少的AH1菌株含有比其他五个菌株更多的抗性基因和毒性基因,这也许与CRISPR-Cas系统阻止可移动元件转移的功能有关。同时,我们在AH1菌株中进行了 CRISPR-Cas系统免疫功能与机制的研究。质粒侵染实验发现,金黄色葡萄球菌的Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统可以阻止含spacer同源序列质粒的转移,且此过程依赖于靶序列的转录。对靶标的识别需要crRNA与靶标RNA的序列互补,其中在crRNA 5'端的碱基配对比3'端的更重要。CRISPR-Cas系统的免疫功能还依赖于Cas蛋白,其中核酸内切酶Cas6和Csm各组分参与了此过程。此外,为了研究临床金黄色葡萄球菌中CRISPR-Cas系统除免疫之外的功能,我们对AH1,AH3和SH3三个菌及它们的CRISPR序列敲除菌株进行了 RNA-seq。高通量测序数据显示,在三个菌株中各自的CRISPR影响了不同基因的表达。其中在AH3菌株中,CRISPR敲除导致了包括氮代谢和毒性相关基因在内的一些基因群的转录水平发生了变化。Real-time PCR的实验结果确认了毒力基因spa和sspABC及调控因子sarS在转录水平的改变。通过以上研究,我们在临床菌株中确定了金黄色葡萄球菌CRISPR-Cas系统的免疫功能。研究发现靶标识别依赖于crRNA与靶RNA的序列互补,而Cas6和CSM复合物对于免疫功能是必需的。对于免疫之外的功能,我们发现CRISPR在金黄色葡萄球菌可参与调节毒性相关基因的表达,但是其中的机制还需要进一步研究确定。
【关键词】:金黄色葡萄球菌 成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关蛋白质系统 全基因组测序 转录组测序 基因表达调控
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R378.11;Q78
【目录】:
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-12
  • 第一章 绪论12-46
  • 1.1 金黄色葡萄球菌简介12-15
  • 1.1.1 引言12
  • 1.1.2 金黄色葡萄球菌的基本生理特征12-13
  • 1.1.3 金黄色葡萄球菌的致病性简介13-15
  • 1.2 金黄色葡萄球菌的基因组简介15-27
  • 1.2.1 引言15-16
  • 1.2.2 金黄色葡萄球菌基因组的基本特征16-19
  • 1.2.3 金黄色葡萄球菌的可移动元件19-27
  • 1.3 CRISPR-Cas系统简介27-38
  • 1.3.1 引言27-28
  • 1.3.2 CRISPR-Cas系统的发现历史与基本特征28
  • 1.3.3 CRISPR-Cas系统的分型与分布28-32
  • 1.3.4 CRISPR-Cas系统的免疫功能研究进展32-35
  • 1.3.5 CRISPR-Cas系统的免疫之外的功能研究进展35-38
  • 1.4 Ⅲ型CRISPR-Cas系统研究进展38-45
  • 1.4.1 引言38
  • 1.4.2 Ⅲ型CRISPR-Cas系统中的免疫效应复合物38-41
  • 1.4.3 Ⅲ型CRISPR-Cas系统免疫机制研究进展41-44
  • 1.4.4 Ⅲ型CRISPR-Cas系统的识别自我与非我的机制44-45
  • 1.5 本课题的研究内容及研究目的45-46
  • 1.5.1 本课题的提出背景45
  • 1.5.2 本课题的研究内容及目的45-46
  • 第二章 实验材料及方法46-68
  • 2.1 实验材料46-55
  • 2.1.1 实验中所使用的菌株46
  • 2.1.2 实验中所使用的质粒46-48
  • 2.1.3 实验中所使用的引物48-53
  • 2.1.4 实验中所使用的培养基53-54
  • 2.1.5 实验中所使用的试剂54-55
  • 2.1.6 实验中所使用的仪器55
  • 2.2 实验方法55-68
  • 2.2.1 细菌的培养条件与感受态制备方法55-57
  • 2.2.2 大肠杆菌相关的分子生物学实验方法57-59
  • 2.2.3 金黄色葡萄球菌相关的生物学实验方法59-65
  • 2.2.4 实验中所使用质粒的构建方法65-66
  • 2.2.5 含Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统临床菌株的筛选方法66-67
  • 2.2.6 金黄色葡萄球菌高通量测序及相关的分析方法67-68
  • 第三章 实验结果及分析68-100
  • 3.1 含Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统临床菌株的鉴定68-76
  • 3.1.1 葡萄球菌中CRISPR-Cas系统的序列分析与筛选引物设计68-69
  • 3.1.2 在临床菌株中通过PCR筛选确定CRISPR-Cas系统阳性的菌株69-72
  • 3.1.3 六个含CRISPR-Cas系统菌株的全基因组测序与菌株分型分析72-76
  • 3.2 葡萄球菌中Ⅲ-A型系统中CRISPR序列的分析76-83
  • 3.2.1 葡萄球菌中Ⅲ-A型CRISPR序列中Repeat序列的比对分析76-78
  • 3.2.2 Ⅲ-A型中CRISPR序列中Spacer序列的比对分析78-80
  • 3.2.3 金黄色葡萄球菌的Ⅲ-A型CRISPR序列中spacer的同源序列分析80-83
  • 3.3 临床菌株中Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统的免疫功能与机制研究83-91
  • 3.3.1 葡萄球菌中Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统免疫对靶标转录依赖性的研究84-87
  • 3.3.2 葡萄球菌中Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统识别靶序列的匹配要求探索87-90
  • 3.3.3 葡萄球菌中Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统中Cas蛋白的功能探索90-91
  • 3.4 CRISPR-Cas系统敲除菌株的非经典功能研究91-100
  • 3.4.1 RNA-Seq测序数据分析92-93
  • 3.4.2 AH3菌株中部分差异表达基因分析及RealTime-PCR检测93-96
  • 3.4.3 AH3菌株中CRISPR-Cas系统对毒力基因表达的调控功能研究96-100
  • 第四章 讨论100-104
  • 4.1 CRISPR-Cas系统的筛选总结100
  • 4.2 Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统中leader序列的功能100-102
  • 4.3 Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统免疫之外的功能分析102-104
  • 参考文献104-114
  • 致谢114-116
  • 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果116

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