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《齐鲁工业大学》 2017年
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埃博霉素A、B的微生物转化及产物抑瘤效果研究

张萌  
【摘要】:埃博霉素,作为一种16元环的大环内酯抗生素,其抗癌活性已经被认可。目前,已经发现的埃博霉素及其衍生物水溶性并不可观,同时该类药物具有较严重的神经毒性等副作用。一直以来,这些问题严重制约了埃博霉素类药物在临床上的应用。为了应对这个问题,本课题将利用微生物转化的方法寻找新的埃博霉素类似物。微生物转化是对天然化合物进行结构改造的一种新兴技术,这种方法能够发现更多的天然化合物的新型衍生物。本课题是利用土壤中的多种微生物分别对埃博霉素进行转化实验,以寻找具有转化作用的菌株并鉴定转化后的产物。研究内容主要分为四个方面。首先是埃博霉素A、B的制备,本课题利用固体发酵技术对纤维堆囊菌进行培养,利用大孔吸附性树脂对纤维堆囊菌的代谢产物—埃博霉素进行富集,然后使用色谱级甲醇对树脂中的埃博霉素进行解吸附。再利用四氯化碳对埃博霉素进行萃取纯化。利用这种方法得到的埃博霉素的总纯度达95%,相比于传统的埃博霉素液体发酵法产物萃取纯度提高了40%左右。第二是转化菌种的筛选,本课题中用于转化实验的菌株均来自于土壤。采集不同环境下的土壤样品,进行微生物的分离纯化,建立菌种库,将菌种库中所有菌种均进行埃博霉素的转化实验,根据高效液相色谱检测,筛选出具有转化作用的菌种,并进行菌种鉴定。在此设计方案下,本课题共采集23种不同环境下的土壤样品,并分离纯化得到262株菌,其中真菌112株,细菌150株。最终筛选到具有转化作用的菌种有5株,其中1株真菌,4株细菌。对筛选到的菌种进行分子学鉴定,这五种菌分别是伯克氏菌,巨大芽孢杆菌,多粘类芽孢杆菌,克雷伯氏菌,以及烟曲霉菌。根据高效液相色谱仪检测,共得到5种转化产物,其中伯克氏菌能够将埃博霉素(AB)转化成两种产物—产物1和产物2;巨大芽孢杆菌能够将埃博霉素B转化为产物2;多粘类芽孢杆菌和克雷伯氏菌具有相同的转化作用,将埃博霉素(AB)转化为两种产物—产物3和产物4;烟曲霉能够将埃博霉素A转化成产物5。接下来本文选取伯克氏菌的转化产物进行制备并做出结构鉴定。首先将伯克氏菌的转化发酵进行放大处理,得到大量的转化产物,之后利用大孔树脂的吸附作用进行富集,再利用色谱级甲醇浸泡树脂进行解吸附,最后利用制备液相色谱对转化产物进行分离和纯化。对两种产物和埃博霉素AB分别进行质谱分析,二级质谱分析以及1H-NMR谱,13C-NMR谱分析,综合所有谱图进行对比分析,最终对产物1和产物2的结构做出最终确认:产物1是由埃博霉素B转化而来,其分子结构是在埃博霉素B的C12-C13位的环氧环发生开环反应,两个C上均连接一个羟基。产物2是由埃博霉素A转化而得,其分子结构是埃博霉素A的C1位和C12至C15片段发生大环内酯的重排反应,原本C1-O-C15的酯键断裂,C15-O-与C12位相连,C12-C13处的环氧环开环,C13-O-与C1位相连。最后对两种转化产物进行抑瘤效果分析。本课题选用人宫颈癌细胞—Hela细胞研究埃博霉素转化产物体外活性。通过MTT实验最终得到产物1的半数抑制率(IC50)为15.6 ng/mL,细胞抑制率为75.4%;产物2的半数抑制率(IC50)为26.4ng/mL,细胞抑制率为79.6%。与埃博霉素A和埃博霉素B相比,两种产物的活性减弱。本课题利用微生物转化的方法得到了埃博霉素的衍生物,这为埃博霉素的微生物转化做出了初步的探讨,同时为埃博霉素衍生物的深入研究奠定了基础。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ927;R96

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