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《山东农业大学》 2017年
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花生ABA途径抗逆基因AhLOS5克隆与抗逆性研究

武晓亮  
【摘要】:花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物和经济作物,以其扎根深、开花量大、花期长、无明显的需水临界期以及水分利用率较高等特点,具有较强的抗旱性,是发展旱作农业和旱薄地开发的理想作物。干旱往往伴随土壤荒漠化、盐渍化的加重,给农业生产带来多种因素的制约。在全球范围内,有2/3的花生分布在旱作地区,缺少灌溉条件加之瘠薄的砂质土壤,使干旱和高盐危害非常普遍,已成为花生生产上分布最广、危害程度最大的限制因素。在我国,常年有70%的花生遭受不同程度的干旱和高盐胁迫,干旱和高盐引起的荚果减产率平均在20%以上。植物对非生物逆境的响应伴随着对生长发育过程很多基因的调控。植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)能参与植物对许多环境胁迫如干旱、冷害、盐害等的生理反应和分子生物学效应。目前ABA已经公认为能够诱导植物产生对不良环境的抗性(抗旱性、抗寒性、抗病性、耐盐性等),是植物的“抗逆诱导因子”。目前公认的高等植物体内的ABA的生物合成主要为间接途径,反应过程中的玉米黄质环氧化酶(ZEP)、9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)、ABA醛氧化酶(AAO)及钼辅因子硫化酶(MCSU)是关键调控酶。本研究从花生栽培品种‘丰花1号’中克隆了钼辅因子硫酸化酶基因AhLOS5,进行了抗逆性鉴定和基因功能验证。构建了含AhLOS5基因的正义和反义植物表达载体,农杆菌介导分别转化三生烟草,获得了不同AhLOS5表达水平的转基因烟草植株,并对这些转基因株系的T1代植株进行了生物学功能分析。通过生理分析、遗传鉴定、分子生物学和生物化学的研究确定AhLOS5应答非生物逆境的机制。具体结果如下:(1)选取了黄淮海花生产区4个主推品种,进行抗旱性鉴定。抗旱性能排名为‘花育20号’‘丰花1号’‘海花1号’‘白沙1016’。(2)在黄淮海花生主产区种植面积较大,同时表现高抗旱性的花生品种‘丰花1号’中成功克隆花生AhLOS5基因。全长2731个碱基,包括2451bp的开放阅读框,115bp的5′非编码区,165bp的3′非编码区,ORF编码816个氨基酸。该基因编码钼辅因子硫酸化酶,属于MOSC超家族。同源性分析证明,我们克隆得到的‘丰花1号’AhLOS5与花生二倍体野生种A.duranensis中的AdLOS5同源性最高,达到94.7%,与AiLOS5同源性为92.2%。与其他高等植物相比,AhLOS5与同属豆科的狭叶羽扇豆、矮沙冬青、木豆、同源性较高,分别为77.7%、73.7%和72.9%,与属十字花科的拟南芥同源性略低,为59.9%。(3)以AhLOS5 cDNA核苷酸片段制备探针对4个主推品种中AhLOS5的表达特性进行了分析。结果显示,AhLOS5在4个主推品种中表达量顺序为‘花育20号’‘丰花1号’‘海花1号’‘白沙1016’。我们发现,4个品种间的AhLOS5基因表达量排序与其抗旱性排序一致。验证了该基因在花生中的抗旱性。(4)采用Northern杂交的方法对‘丰花1号’中AhLOS5的表达特性进行了分析。结果表明,AhLOS5在花生中组成型表达,花生各器官中表达量顺序为花成熟叶幼果果针根茎,在叶片中的表达量随着叶龄的增加而增加,在叶片展开第50d达到峰值。AhLOS5的表达还受干旱和盐胁迫诱导,诱导作用明显。(5)构建了2种植物表达载体,即含正义AhLOS5的载体pBI-LOS5和含反义AhLOS5的载体pBI-R-LOS5。以三生烟草为转化受体,采用农杆菌介导的方法,将上述2种载体分别转化。转不同载体的转基因烟草当代(T0代)所结的种子,经卡那霉素筛选,并结合转基因株系的T1代植株PCR鉴定结果,初步确定,含反义AhLOS5的转基因植株有20株,含正义AhLOS5的转基因植株有52株,并选取部分不同类型的转基因植株进行了Northern杂交分析。(6)通过转基因烟草植株种子根长、叶绿素含量、相对含水量、相对电导率、丙二醛(MDA)、抗坏血酸(ASA)、抗氧化酶活性(SOD,POD,CAT,APX)、内源ABA、脯氨酸等生理生化指标检测发现,在干旱和盐胁迫下,过表达AhLOS5的转基因烟草转基因植株体内内源ABA含量显著升高,抗氧化酶活性明显升高,膜脂完整性好,渗透调节物质含量高。过表达AhLOS5能够明显的提高转基因株系对干旱和盐胁迫的抗性。(7)用Northern blot方法对转基因烟草中另外3个抗逆相关基因DREB2B,RD22,P5CS表达进行检测。结果显示,在干旱和盐胁迫下,正义转基因和野生型对照植株的3个基因DREB2B,RD22,P5CS都诱导表达;而反义转基因植株中只有不依赖ABA的抗逆基因DREB2B诱导表达,依赖ABA的抗逆基因RD22和P5CS都不诱导表达。这证明了AhLOS5参与的植物抗逆途径属于依赖ABA途径,过表达AhLOS5转基因烟草获得的抗逆性是由胁迫诱导产生的内源ABA调控的。
【关键词】:花生 干旱胁迫 盐胁迫 脱落酸 AhLOS5
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2;S565.2
【目录】:
  • 中文摘要9-11
  • Abstract11-13
  • 1 前言13-23
  • 1.1 花生在国民经济中的地位13-14
  • 1.2 植物的抗逆性14-17
  • 1.3 ABA与逆境胁迫17-19
  • 1.4 ABA相关的抗逆基因工程19-21
  • 1.5 本研究的目的意义21-23
  • 2 材料与方法23-39
  • 2.1 材料23-24
  • 2.1.1 植物材料23
  • 2.1.2 载体与菌株23
  • 2.1.3 酶及生化试剂23
  • 2.1.4 PCR引物23-24
  • 2.2 实验方法24-38
  • 2.2.1 花生培养与胁迫处理24
  • 2.2.2 花生抗旱性鉴定24
  • 2.2.3 叶片萎蔫指数的测定24-25
  • 2.2.4 植物组织总RNA的提取25
  • 2.2.5 反转录cDNA第一链合成25-26
  • 2.2.6 cDNA纯化26
  • 2.2.7 PCR反应扩增目的片段26-27
  • 2.2.8 连接反应27
  • 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞制备和转化27-28
  • 2.2.9.1 大肠杆菌感受态细胞制备27
  • 2.2.9.2 目的片段转化大肠杆菌感受态细胞27-28
  • 2.2.10 小量碱法提取质粒DNA28-29
  • 2.2.11 DNA序列测定29-30
  • 2.2.11.1 酶切连接到植物表达载体29
  • 2.2.11.2 感受态细胞的制备29-30
  • 2.2.11.3 农杆菌的冻融法转化30
  • 2.2.12 农杆菌介导的烟草转化30-32
  • 2.2.12.1 培养农杆菌30
  • 2.2.12.2 农杆菌介导的烟草转化30-31
  • 2.2.12.3 转基因植株的筛选31-32
  • 2.2.12.4 转基因植株的PCR检测32
  • 2.2.13 Northern Blot检测32-34
  • 2.2.13.1 烟草RNA的变性凝胶电泳32-33
  • 2.2.13.2 RNA转膜33
  • 2.2.13.3 合成Northern blot探针33-34
  • 2.2.13.4 预杂交及杂交34
  • 2.2.14 叶绿素含量测定34
  • 2.2.15 胁迫状态下相对含水量(RWC)测定34
  • 2.2.16 丙二醛含量(MDA)测定34-35
  • 2.2.17 抗氧化酶(APX,POD,SOD,CAT)测定35-37
  • 2.2.17.1 抗坏血酸过氧化物酶(APX)测定35
  • 2.2.17.2 超氧化物歧化酶(SOD)测定35-36
  • 2.2.17.3 过氧化物酶含量(POD)测定36
  • 2.2.17.4 过氧化氢酶(CAT)测定36-37
  • 2.2.17.5 抗氧化物质(GSH和ASA)含量的测定37
  • 2.2.18 渗透调节物质脯氨酸(Proline)含量测定37-38
  • 2.2.19 内源ABA含量测定38
  • 2.3 数据统计分析38-39
  • 3 结果与分析39-66
  • 3.1 花生AhLOS5的克隆及序列分析39-45
  • 3.1.1 花生总RNA的提取及逆转录39
  • 3.1.2 花生AhLOS5基因中间片段的克隆与测序39-40
  • 3.1.3 花生AhLOS5基因 3′端的克隆与测序40
  • 3.1.4 花生AhLOS5基因 5′端的克隆与测序40-41
  • 3.1.5 花生AhLOS5基因全长cDNA序列的获得41-45
  • 3.2 花生AhLOS5基因表达分析45-49
  • 3.2.1 花生AhLOS5基因表达时空特征45-49
  • 3.2.1.1 AhLOS5基因在花生各组织的表达特征45
  • 3.2.1.2 AhLOS5基因在花生叶片不同发育时期的表达特征45-46
  • 3.2.1.3 AhLOS5基因表达受多种胁迫诱导46-47
  • 3.2.1.4 AhLOS5基因表达与花生抗旱性关系47-49
  • 3.3 花生AhLOS5转化烟草研究49-66
  • 3.3.1 植物表达载体的构建49-51
  • 3.3.2 根癌农杆菌的转化51-52
  • 3.3.3 再生植株的获得52
  • 3.3.4 T0代转基因植株的鉴定52-53
  • 3.3.4.1 转基因植株的PCR鉴定52-53
  • 3.3.4.2 转基因植株的Northern blot53
  • 3.3.5 T1代转基因植株的鉴定及转基因的分离53-55
  • 3.3.6 转基因植株耐旱性检测55-60
  • 3.3.6.1 过表达AhLOS5的转基因植株耐旱性明显高于WT和反义转基因植株55-56
  • 3.3.6.2 过表达AhLOS5转基因植株耐旱机制研究56-60
  • 3.3.7 转基因植株耐盐性检测60-64
  • 3.3.7.1 过表达AhLOS5的转基因植株耐盐性明显高于WT和反义转基因植株60-61
  • 3.3.7.2 过表达AhLOS5转基因植株耐盐机制研究61-64
  • 3.3.8 干旱及盐胁迫相关调控基因的表达分析64-66
  • 4 讨论66-70
  • 5 结论70-71
  • 参考文献71-82
  • 致谢82-83
  • 攻读学位期间获得成果情况83

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