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《山东农业大学》 2017年
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AP-3调控拟南芥PAT10液泡运输途径和花粉管生长

冯强楠  
【摘要】:植物液泡作为植物中特有的细胞器,通过调控离子平衡、次生代谢物质储存维持渗透压等参与植物响应环境信号、生长发育等生命过程。定位在液泡膜上的离子转运蛋白、酶类等对于液泡发挥这些功能至关重要。这些蛋白质经内质网后通过多条途径到达液泡。两条经典的运输途径,经COP(40)(40)复合体介导从内质网到达高尔基体后由小G蛋白Rab5或者Rab5和Rab7共同介导到达液泡;一条是由衔接蛋白复合体3(Adaptor Protein Complex-3,AP-3)参与的过程,但该过程的分子机理研究甚少,只有少数底物研究的报道;最新被发现的一条途径是内质网直接靶向液泡膜的途径,该过程的分子机理也尚不清楚。本研究发现棕榈酰基转移酶10(Protein S-Acyl Transferase 10,PAT10)靶向液泡膜不受Rab5-DN的阻断,这就暗示PAT10通过非经典的运输途径靶向液泡膜。为了探究非经典运输途径的参与因子以及特异性识别序列,本研究利用PAT10-GFP的材料进行了基于荧光的正向遗传学筛选、遗传干扰、结构域解析及创制嵌合蛋白等实验,主要结果和结论如下:(1)PAT10经非经典的运输途径靶向液泡膜经典的运输途径可以被小G蛋白Rab5-DN(Dominant negative)形式阻断,Rab5-DN形式可以竞争性的结合內源的GEF蛋白,从而导致对內源的Rab5蛋白功能的遗传干扰。本研究首先利用细胞特异性启动子驱动Rab5-DN的表达可以阻断肌醇转移载体INT1(Inositiol Transporter 1)靶向液泡膜的运输,INT1是已知的从内质网经高尔基的囊泡运输途径到达液泡膜上的跨膜蛋白。证明这种遗传干扰确实能够阻断经高尔基体的液泡运输途径。将Rab-5DN转基因材料通过杂交引入PAT10-GFP植株中,通过荧光成像发现Rab5-DN的表达并没有干扰PAT10在液泡膜上的定位。这暗示PAT10在内质网上合成后,不经过TGN直接到达液泡膜,即PAT10经非经典的运输途径靶向液泡膜。(2)PAT10的酶活区和C端对其亚细胞定位十分关键PAT10的蛋白结构相对简单,包括4个跨膜区、酶活区以及N-和C-端非催化区。本研究通过体外DNA操作,对PAT10的不同结构域进行缺失,并将GFP-融合的嵌合蛋白引入到pat10-1中。通过对pat10-1表型互补与否,亚细胞定位如何,以及对Rab5-DN及药剂干扰的响应等研究,我们发现:N端缺失的嵌合蛋白可以互补突变体的表型,不影响PAT10定位到液泡膜上,但受Rab5-DN阻断,说明N端影响PAT10的运输途径;酶活区以及C端缺失的嵌合蛋白不能互补突变体的表型,定位发生改变,说明酶活区以及c端对于pat10的功能和定位十分关键。(3)pat10经ap-3途径靶向液泡为了探究pat10经哪条运输途径靶向液泡膜,以及该途径都有哪些调控因子参与。本研究对pat10-gfp;pat10-1的材料进行了ems诱变,又由于花粉是单倍体,经诱变后m0代即可表现出表型,并且其孢子体有一个拷贝是野生型的,可以排除孢子体对花粉的影响,该方法可以显著减少筛选的时间。本研究对pat10-gfp;pat10-1诱变的m0植株材料的花粉管进行了pat10-gfp定位的筛选,并且获得了两个突变材料,分别命名为reva1-1和reva1-2。通过图位克隆以及测序的方法,我们发现reva1编码ap-3δ亚基。将pat10-gfp通过杂交的方法引入到ap-3δ亚基的t-dna插入突变体pat4-2中,发现同reva1-1和reva1-2中结果一致,pat10-gfp定位到高尔基上。等位检测以及互补实验都证明pat10经ap-3介导从高尔基靶向液泡膜。(4)cop(40)(40)的小g蛋白sar1参与ap-3运输途径cop(40)(40)介导囊泡从内质网到高尔基的运输过程。利用cop(40)(40)复合体的小g蛋白sar1-dn可以阻断该运输途径。首先利用细胞特异性启动子驱动sar1c-dn的表达可以阻断int1靶向液泡膜的运输,证明这种遗传干扰确实能够阻断内质网到高尔基的囊泡运输途径。蔗糖转运蛋白suc4和pat10-gfp在ap-3δ亚基的突变体中的信号滞留在高尔基上(wolfenstetteretal.,2012),这就暗示ap-3在高尔基上介导囊泡运输靶向液泡。为了探究是否由cop(40)(40)介导这些蛋白质从内质网靶向高尔基,本研究通过瞬时转化体系以及杂交的手段将gfp-suc4和pat10-gfp引入到sar1c-dn的材料中,发现suc4和pat10在该遗传干扰的材料中液泡膜的信号减弱,这表明ap-3运输的蛋白经cop(40)(40)途径从内质网到达高尔基。(5)hops参与ap-3介导的囊泡与液泡的融合酵母中的研究表明hops复合体参与了囊泡的融合过程。为了探究ap-3介导的囊泡到达液泡附近后是否由hops介导与液泡融合。本研究利用hops复合体的vps41亚基的突变体进行了研究。由于vps41-1的花粉管不能传代,不能获得vps41-1纯和突变体,所以本研究利用花粉管作为系统进行了pat10-gfp定位的分析。通过荧光成像发现,在vps41-1花粉管中pat10的定位变成了点状,为了排除该点状的结构不是变形的液泡,本研究利用化学染料Oregon Green对花粉管进行了染色以及三维重构了花粉管中液泡,结果表明vps41-1的花粉管中液泡形态确实出现异常,但与PAT10以及CBL2的定位并不一致,CBL2-RFP在野生型中是液泡膜的定位,在vps41-1花粉管中的定位变成了质膜。说明HOPS参与了AP-3介导的囊泡与液泡融合过程。(6)AP-3介导的液泡融合过程调控花粉管的生长花粉管的生长对植物能够成功完成有性生殖过程十分重要。液泡储藏物质以及蛋白的运输和液泡的动态组装对花粉管生长十分关键,但起关键作用的因子并不清楚。本研究中报道了衔接蛋白复合体AP-3及两个定位在液泡膜上的蛋白在花粉管生长过程中发挥重要功能。拟南芥中AP-3调控多种蛋白质靶向液泡膜的运输,其中棕榈酰基转移酶10(PAT10)和SNARE蛋白VAMP711分别参与了钙离子信号的转导过程和液泡膜的动态融合过程。复合体AP-3各亚基的缺失突变会影响雄配子传代率,通过分析各亚基的突变体发现,AP-3功能缺失影响了花粉管体外和体内的生长过程,而不影响花粉的发育和导向性生长过程。PAT10和VAMP711功能缺失也影响了花粉的生长过程,暗示经AP-3介导的PAT10和VAMP711到达液泡膜的过程对于花粉管生长至关重要。本研究中还展示了AP-3的功能缺失影响了液泡的动态组装过程,野生型花粉管中液泡呈现为管状结构,但突变体中管状结构的液泡显著减少,并且在液泡的末端会形成球状结构。本研究证明了AP-3在生殖过程中发挥重要功能,为研究液泡参与调控细胞极性生长过程提供了新的线索。
【关键词】:液泡运输途径 基于荧光的正向遗传学 AP-3 棕榈酰基转移酶 CBL家族 COP(40)(40) HOPS复合体 花粉管生长
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q945
【目录】:
  • 符号说明5-10
  • 中文摘要10-13
  • Abstract13-17
  • 1 前言17-32
  • 1.1 植物内膜系统间的囊泡运输途径17-26
  • 1.1.1 植物细胞内液泡运输途径18
  • 1.1.2 植物液泡运输途径参与因子18-26
  • 1.1.2.1 COPII复合体19-20
  • 1.1.2.2 AP复合体20-22
  • 1.1.2.3 Rab小G蛋白22-24
  • 1.1.2.4 Tethering复合体24-25
  • 1.1.2.5 SNAREs25-26
  • 1.2 蛋白质DHHC-CRD类棕榈酰基转移酶家族26-29
  • 1.2.1 拟南芥中棕榈酰基转移酶27-28
  • 1.2.2 棕榈酰基转移酶的定位分析28
  • 1.2.3 棕榈酰基转移酶底物的运输途径28-29
  • 1.3 花粉管的生长29-30
  • 1.3.1 钙离子与花粉管生长29-30
  • 1.3.2 液泡动态组装与花粉管生长30
  • 1.4 本研究的目的与意义30-32
  • 2 材料与方法32-50
  • 2.1 材料32-35
  • 2.1.1 植物材料及生长条件32-33
  • 2.1.2 菌株和质粒33
  • 2.1.3 酶及生化试剂33-34
  • 2.1.4 PCR引物34-35
  • 2.2 方法35-50
  • 2.2.1 构建转基因植物表达载体35-40
  • 2.2.1.1 植物总RNA的提取(试剂盒法)35
  • 2.2.1.2 反转录35-36
  • 2.2.1.3 植物基因组DNA提取(SDS法)36-37
  • 2.2.1.4 高保真Phusion PCR扩增37
  • 2.2.1.5 PCR产物回收(试剂盒法)37-38
  • 2.2.1.6 TOPO连接反应38
  • 2.2.1.7 大肠杆菌转化及质粒提取(试剂盒法)38-39
  • 2.2.1.8 DNA序列测定39
  • 2.2.1.9 LR反应39-40
  • 2.2.1.10 质粒DNA的酶切鉴定40
  • 2.2.2 农杆菌介导的拟南芥遗传转化40-42
  • 2.2.2.1 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化40-41
  • 2.2.2.2 拟南芥的栽培及转化41-42
  • 2.2.3 qRT-PCR42
  • 2.2.3.1 引物设计及合成42
  • 2.2.3.2 反应条件及结果分析42
  • 2.2.4 EMS诱变和图位克隆42-43
  • 2.2.5 GUS染色分析43-44
  • 2.2.6 扫描电子显微镜观察44
  • 2.2.7 拟南芥花粉染色及花粉萌发分析44-46
  • 2.2.8 拟南芥叶肉原生质体的制备及转化46-47
  • 2.2.9 激光共聚焦扫描隧道显微镜观察及图像处理47-48
  • 2.2.10 药剂处理及荧光染料染色48-50
  • 2.2.10.1 FM4-64 染色48
  • 2.2.10.2 BFA处理48
  • 2.2.10.3 2-BP处理48
  • 2.2.10.4 Oregon Green花粉管染色48-50
  • 3 结果与分析50-99
  • 3.1 调控PAT10靶向液泡特异序列的筛选50-65
  • 3.1.1 PAT10通过非经典运输途径靶向液泡50-53
  • 3.1.2 PAT10的酶活区以及碳端对其亚细胞定位起关键作用53-57
  • 3.1.3 PAT11经Rab5介导靶向液泡膜57-59
  • 3.1.4 PAT11的功能分析59-62
  • 3.1.5 PAT10与PAT11结构域互换62-65
  • 3.2 调控PAT10靶向液泡运输途径反式作用元件的筛选65-85
  • 3.2.1 基于荧光的正向遗传学筛选65-66
  • 3.2.2 PAT10由AP-3 介导靶向液泡膜66-71
  • 3.2.3 PAT10在ap-3 突变体中的定位发生改变71-72
  • 3.2.4 PAT10在AP-3 复合体突变体中的定位及互补72-74
  • 3.2.5 PAT10的底物CBL2在ap-3 突变体中的定位发生改变74-77
  • 3.2.6 小G蛋白SAR1c参与PAT10的运输77-81
  • 3.2.7 HOPS复合体参与AP-3 介导的液泡运输81-84
  • 3.2.8 工作模型84-85
  • 3.3 AP-3 通过调控液泡蛋白运输以及液泡的动态调控花粉管的生长85-99
  • 3.3.1 AP-3 功能缺失导致种子数目减少85-86
  • 3.3.2 ap-3 突变体雄配子传代出现异常86-88
  • 3.3.3 AP-3 功能缺失导致花粉管生长变短而不影响导向88-93
  • 3.3.4 AP-3 通过调控PAT10的定位来参与花粉管的生长93-95
  • 3.3.5 AP-3 通过调控VAMP711的定位来参与花粉管的生长95-97
  • 3.3.6 AP-3 参与调控花粉管中液泡的动态组装97-99
  • 4 讨论99-105
  • 4.1 拟南芥PAT10和PAT11的运输途径和底物特异性99-100
  • 4.2 衔接蛋白复合体AP-3 底物的识别100-101
  • 4.3 CBL2的定位取决于PAT10101
  • 4.4 COP(40)(40)介导的囊泡在内质网不同出芽点的分拣过程101-102
  • 4.5 HOPS复合体参与Rab5介导的囊泡运输途径和AP-3 参与的囊泡运输途径102
  • 4.6 AP-3 在花粉管的快速生长过程中发挥重要作用102-103
  • 4.7 PAT10对花粉管的生长起关键作用103-104
  • 4.8 SNAREs蛋白家族成员VAMP711调控花粉管的生长104-105
  • 5 结论105-106
  • 参考文献106-115
  • 致谢115-117
  • 攻读学位期间发表论文情况117

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