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《山东农业大学》 2017年
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番茄SUMO E3连接酶SlSIZ1的功能分析

张耸  
【摘要】:植物在生长发育过程中会遭受多种非生物胁迫,例如强光、干旱、极端温度等,对植物的正常生理活动和生长发育产生显著的影响。翻译后修饰是一种重要调节机制,SUMO化修饰是近些年来发现的一种较新的翻译后修饰。SUMO蛋白利用E1(激活酶)、E2(结合酶)、E3(连接酶)对底物蛋白进行修饰。SUMO化修饰可以调节植物对高温、低温、干旱、盐等非生物胁迫的响应,也可以调节植物的生长发育、信号转导及营养代谢等。SIZ1是一种SUMO E3连接酶,主要作用是介导SUMO蛋白和底物蛋白的特异性结合,大多数的SUMO化都需要SUMO E3连接酶的介导。因此很多学者都通过对SIZ1的研究来探索植物体内SUMO化的功能。SIZ1可以调节植物对高温、低温、干旱、过量铜离子等非生物胁迫的响应。番茄是一种起源于热带的重要蔬菜作物,但是其高温抗性并不强,而且高温常常伴随着干旱,对番茄造成严重伤害,导致产量降低或者死亡。SIZ1可以通过介导SUMO化调节植物对高温和干旱的响应,在番茄中尚无对SIZ1的研究。因此,探讨SlSIZ1在调节番茄响应高温和干旱胁迫中的作用具有重要的理论和现实意义。我们从番茄中克隆得到SlSIZ1基因。以拟南芥、烟草和番茄为材料,研究SlSIZ1是否具有SUMO E3连接酶的特性,探讨其在调节植物干旱和高温抗性中的功能,主要结果如下:(1)对番茄进行低温(4°C)、高温(42°C)、干旱(聚乙二醇,PEG)和氧化胁迫(MV,甲基紫精)处理,检测SUMO化情况。发现经过这几种处理后番茄体内的SUMO化程度都升高,在低温、高温和干旱胁迫处理下SUMO化程度增加较为明显,而在氧化胁迫处理下,番茄体内的SUMO化水平变化不明显。(2)从番茄叶片中克隆得到SlSIZ1基因(GenBank注册号:KP323389),该基因开放阅读框长2658bp,编码886个氨基酸,预测蛋白分子量约为97.35kDa,等电点预测为4.92,生物信息学分析发现其位于番茄11号染色体上。(3)qRT-PCR分析发现,SlSIZ1基因在番茄的根、茎、叶、花中均有表达,在叶片中表达量最高。同时该基因受高温、低温、干旱、盐等胁迫的诱导表达,但变化不明显。说明SlSIZ1主要是通过介导SUMO化修饰,而不仅仅是通过其表达量的变化来调节植物对逆境的响应。亚细胞定位分析显示SlSIZ1定位于细胞核中。(4)对SlSIZ1进行序列分析发现其具有SIZ1蛋白的五个保守结构域,并且将SlSIZ1转化拟南芥siz1-2突变体,可以部分恢复突变体植株矮小、叶片狭窄、对ABA敏感以及SUMO化积累降低等表型,可以调节和介导植物体内的SUMO化,说明SlSIZ1具有SUMO E3连接酶的活性。(5)干旱胁迫下,过表达SlSIZ1可以降低烟草中ROS的积累,增加渗透调节物质(游离脯氨酸)的含量,减少生物膜损伤(MDA)、叶片坏死和失绿,上调逆境相关基因表达,增加体内SUMO化积累,维持较高的种子萌发率和生长情况,提高转基因烟草对干旱胁迫的抗性。(6)高温胁迫下,过表达SlSIZ1可以减少番茄体内ROS的积累,增加抗氧化酶活性,减少生物膜损伤(MDA)和细胞死亡,增加体内SUMO化积累,过表达番茄中具有较高的叶绿素含量和小苗鲜重。同时SlSIZ1可以与SlHsfA1互作,介导SlHsfA1发生SUMO化修饰,促使SlHsfA1在高温胁迫下具有更高的转录活性,上调下游高温相关基因表达(SlHsfA2、SlHsp70、SlHsp70-3和SlHsp90)。高温胁迫时,过表达SlSIZ1番茄中Hsp70基因上调表达,经过放线菌酮处理后Hsp70蛋白降解程度较低,因此过表达番茄植株中含有更多的Hsp70,增加其高温抗性。由于发现SlSIZ1和SlHsp70间可能存在较弱的蛋白互作,我们推测SlSIZ1介导的SUMO化可以修饰SlHsp70,从而维持其稳定。因此,过表达SlSIZ1可以提高番茄的高温抗性。
【关键词】:SUMO化 SlSIZ1 高温胁迫 干旱胁迫 番茄 烟草
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2;S641.2
【目录】:
  • 中文摘要13-15
  • Abstract15-17
  • 1 前言17-35
  • 1.1 SUMO结构及SUMO化过程17-22
  • 1.1.1 翻译后修饰17-18
  • 1.1.2 SUMO蛋白的发现18
  • 1.1.3 SUMO蛋白结构18
  • 1.1.4 SUMO化过程18-20
  • 1.1.5 参与SUMO化过程的酶20-22
  • 1.1.5.1 类泛素蛋白加工酶20
  • 1.1.5.2 SUMO激活酶(E1)20
  • 1.1.5.3 SUMO结合酶(E2)20
  • 1.1.5.4 SUMO E3连接酶20-21
  • 1.1.5.5 SUMO E4连接酶21
  • 1.1.5.6 SUMO泛素E3连接酶(STUbL)21-22
  • 1.2 植物体内SUMO化功能22-26
  • 1.2.1 SUMO化在植物逆境胁迫下的功能22-24
  • 1.2.1.1 高温胁迫22
  • 1.2.1.2 低温胁迫22-23
  • 1.2.1.3 干旱胁迫23
  • 1.2.1.4 盐胁迫23-24
  • 1.2.2 SUMO化在营养代谢方面的功能24-25
  • 1.2.2.1 磷元素胁迫24
  • 1.2.2.2 氮元素吸收24
  • 1.2.2.3 铜离子胁迫24-25
  • 1.2.3 SUMO化在植物生长发育中的作用25
  • 1.2.4 SUMO化对信号途径的调节25
  • 1.2.5 SUMO化对植物花期的调节25-26
  • 1.2.6 SUMO化对植物抗病的调节26
  • 1.3 植物中的SUMO E3连接酶SIZ126-27
  • 1.3.1 SIZ1的基本结构26
  • 1.3.2 SIZ1的基本功能26-27
  • 1.4 干旱、高温对植物的影响27-33
  • 1.4.1 干旱对植物的影响27-29
  • 1.4.1.1 活性氧的产生28
  • 1.4.1.2 活性氧的清除28-29
  • 1.4.1.3 植物的耐旱响应29
  • 1.4.2 高温对植物的影响29-30
  • 1.4.2.1 高温对植物体内ROS的影响30
  • 1.4.2.2 高温对生物膜的影响30
  • 1.4.3 植物的耐高温响应30-33
  • 1.4.3.1 HSPs在植物响应高温中的作用31-32
  • 1.4.3.2 HSFs在植物响应高温胁迫中的调节作用32-33
  • 1.4.3.3 HSFs与SUMO化间的关系33
  • 1.5 本研究的目的及其意义33-35
  • 2 材料与方法35-65
  • 2.1 实验材料35-39
  • 2.1.1 植物材料35
  • 2.1.2 材料的培养35
  • 2.1.3 菌株与载体35-36
  • 2.1.4 酶与各种生化试剂36
  • 2.1.5 所用抗体36-38
  • 2.1.6 培养基38-39
  • 2.2 实验方法39-65
  • 2.2.1 植物总RNA的提取39-40
  • 2.2.2 cDNA第一条链的合成40
  • 2.2.3 番茄SlSIZ1基因的克隆40-41
  • 2.2.4 目的片段的回收41-42
  • 2.2.5 目的片段与克隆载体的连接42-43
  • 2.2.5.1 Blunt载体平末端连接反应42
  • 2.2.5.2 TOPO连接反应42-43
  • 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备43
  • 2.2.7 转化及克隆筛选43-44
  • 2.2.8 大肠杆菌质粒DNA的提取44
  • 2.2.9 目的片段与表达载体的连接44-45
  • 2.2.9.1 T4酶连接法44-45
  • 2.2.9.2 LR反应45
  • 2.2.10 重组质粒的双酶切鉴定45
  • 2.2.11 农杆菌感受态细胞的制备及转化45-46
  • 2.2.11.1 农杆菌感受态细胞的制备45-46
  • 2.2.11.2 农杆菌转化46
  • 2.2.12 SlSIZ1的亚细胞定位46-47
  • 2.2.12.1 SlSIZ1-GFP表达载体的构建46
  • 2.2.12.2 烟草瞬时转化步骤46-47
  • 2.2.13 酵母双杂交47-49
  • 2.2.13.1 表达载体的构建47
  • 2.2.13.2 酵母感受态细胞(乙酸锂法)制备47-48
  • 2.2.13.3 酵母感受态细胞的转化48-49
  • 2.2.13.4 Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)测定49
  • 2.2.14 实时定量荧光PCR49-50
  • 2.2.15 SlSIZ1蛋白原核表达及Western杂交50-54
  • 2.2.15.1 原核表达载体的构建50
  • 2.2.15.2 大肠杆菌BL21原核表达50-51
  • 2.2.15.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳51-52
  • 2.2.15.4 Western杂交52-54
  • 2.2.16 体内SUMO化分析54-55
  • 2.2.16.1 表达载体的构建54-55
  • 2.2.16.2 瞬时转化本生烟草55
  • 2.2.16.3 SUMO化检测55
  • 2.2.17 双分子荧光互补(BiFC)55-56
  • 2.2.17.1 构建双分子荧光互补载体及本生烟草转化55
  • 2.2.17.2 激光共聚焦扫描显微镜观察及处理55-56
  • 2.2.18 农杆菌介导的番茄转化56-58
  • 2.2.19 农杆菌介导的烟草转化58-59
  • 2.2.20 拟南芥的遗传转化59-60
  • 2.2.21 转基因植株的检测60-61
  • 2.2.21.1 CTAB微量法提取基因组DNA60-61
  • 2.2.21.2 转基因植株的PCR检测61
  • 2.2.21.3 转基因植株的qRT-PCR检测61
  • 2.2.21.4 转基因植株的Western杂交61
  • 2.2.22 生理指标的测定61-64
  • 2.2.22.1 叶绿素含量的测定61
  • 2.2.22.2 植株生长量测定61
  • 2.2.22.3 叶片台盼蓝染色61
  • 2.2.22.4 电解质外渗量测定、膜脂过氧化程度测定61-62
  • 2.2.22.5 DAB和NBT染色分析及O_2~(·?)与H_2O_2含量的测定62
  • 2.2.22.6 APX、POD和CAT酶活性的测定62-64
  • 2.2.23 所用处理软件64-65
  • 3 结果与分析65-89
  • 3.1 不同胁迫下番茄体内的SUMO化分析65-66
  • 3.2 SlSIZ1基因的分离及特征66-68
  • 3.2.1 SlSIZ1基因全长序列的克隆66-67
  • 3.2.2 SlSIZ1核苷酸和氨基酸序列分析67-68
  • 3.3 SlSIZ1蛋白的亚细胞定位68-69
  • 3.4 SlSIZ1基因在大肠杆菌中的表达69
  • 3.5 SlSIZ1基因在番茄中的表达分析69-71
  • 3.5.1 SlSIZ1基因在番茄组织器官中的表达69-70
  • 3.5.2 SlSIZ1基因在其它逆境胁迫及信号物质下的表达分析70
  • 3.5.3 SlSIZ1基因在高温胁迫下的表达分析70-71
  • 3.6 SlSIZ1在拟南芥siz1-2 突变体中的转化71-72
  • 3.6.1 SlSIZ1基因正义表达载体的构建71-72
  • 3.6.2 转SlSIZ1拟南芥植株的鉴定72
  • 3.7 SlSIZ1可以部分恢复拟南芥siz1-2 突变体的表型72-75
  • 3.7.1 SlSIZ1可以部分恢复拟南芥siz1-2 突变体植株矮小的表型72-74
  • 3.7.2 SlSIZ1可以部分恢复拟南芥siz1-2 突变体对ABA敏感的表型74
  • 3.7.3 SlSIZ1部分恢复拟南芥siz1-2 突变体在逆境下的SUMO化程度74-75
  • 3.8 SlSIZ1具有SUMO E3连接酶功能75
  • 3.9 SlSIZ1基因在烟草中的遗传转化75-80
  • 3.9.1 过表达SlSIZ1基因烟草的获得75-76
  • 3.9.2 过表达SlSIZ1增加烟草的干旱抗性76-80
  • 3.9.2.1 干旱胁迫下幼苗的生长情况76-77
  • 3.9.2.2 干旱胁迫下成苗的生长情况77-78
  • 3.9.2.3 过表达SlSIZ1可以减少ROS的积累78-80
  • 3.9.2.4 过表达SlSIZ1可以促进烟草体内的SUMO化积累80
  • 3.10 SlSIZ1基因在番茄中的遗传转化80-89
  • 3.10.1 过表达SlSIZ1基因番茄的获得80-81
  • 3.10.2 过表达SlSIZ1增加番茄耐热性81-89
  • 3.10.2.1 高温胁迫下WT植株和转基因植株的生长状况81-82
  • 3.10.2.2 过表达SlSIZ1可以减少高温胁迫下番茄体内ROS的积累82-84
  • 3.10.2.3 高温相关基因表达情况84-85
  • 3.10.2.4 过表达SlSIZ1增加了番茄体内的SUMO化积累85
  • 3.10.2.5 过表达株系中有较高的Hsp70含量85-86
  • 3.10.2.6 SlHsfA1与SlSIZ1间存在互作86-87
  • 3.10.2.7 SlHsfA1可以被Sl SIZ1介导的SUMO化修饰87-89
  • 4 讨论89-96
  • 4.1 逆境会诱导番茄体内的SUMO化水平并且调节SlSIZ1基因的表达89-90
  • 4.2 SlSIZ1是番茄中的SUMO E3连接酶90-91
  • 4.3 过表达SlSIZ1提高了转基因烟草的干旱和转基因番茄的高温抗性91-92
  • 4.4 过表达SlSIZ1可以降低番茄在高温和干旱胁迫下ROS的积累92
  • 4.5 过表达株系中SUMO化水平提高有利于增加干旱和高温耐受能力92-93
  • 4.6 SlSIZ1增加番茄高温耐受能力的分子机制93-96
  • 5 结论96-97
  • 参考文献97-105
  • 致谢105-106
  • 攻读学位期间发表的论文106

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