收藏本站
《山东农业大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因SlGGP-LIKE的功能分析

杨东岳  
【摘要】:番茄起源于热带,是喜温类蔬菜,因此当气温较低时,番茄生长发育迟缓,影响茎、叶生长,长时间的低温环境则会导致植株死亡。同时,低温影响根系对磷、钙、钾、镁等营养元素的吸收和利用,使叶片黄化加剧。低温条件会导致细胞膜透性降低,活性氧增加,酶系功能改变,引起细胞代谢的变化和功能紊乱,发生低温生理伤害。抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)又叫维生素C(Vitamin C,Vc),是一种水溶性抗氧化有机小分子,在植物中广泛存在,参与体内活性氧清除,调控细胞分裂和细胞生长,并可作为某些氧化还原酶的辅酶参与多种生理过程。在人体内,抗坏血酸是高效的抗氧化剂,可以保护身体免于自由基的威胁,维持免疫功能,提高免疫力。另外,在环境变化时,番茄极易染病,导致番茄植株萎蔫,黄化矮缩,严重时会造成番茄果实大面积腐烂,从而导致作物减产。GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGP)是植物抗坏血酸L-半乳糖途径合成的关键酶之一。近几年来在植物衰老和逆境胁迫研究中,抗坏血酸作为生物体内对自由基伤害产生的相应保护系统成员之一,更引起了人们的研究兴趣。因此,研究番茄GGP基因的功能,具有重要的科学意义。本研究从番茄中克隆了一个细胞核定位的抗坏血酸合成基因(SlGGP-LIKE),并以转反义SlGGP-LIKE的番茄和过表达SlGGP-LIKE的烟草为材料,探讨了SlGGP-LIKE基因在耐低温、病原菌和氧化胁迫等方面的功能。主要结果如下:(1)从番茄叶片中分离得到SlGGP-LIKE基因(GenBank序列号:XM_004231938.2),该基因全长为2092bp,开放阅读框为1317bp,编码438个氨基酸,具有两个保守区-HIT(histidine triad)序列和NLS(nuclear localization sequence)序列。预测分子量为49kDa,该基因位于番茄2号染色体上。(2)RT-qPCR分析发现,SlGGP-LIKE在番茄的根、茎、叶、花和果实中均有表达,其中,该基因在叶片中的表达量最高。同时,低温、MV、强光、NaCl、SA和病原菌均可诱导SlGGP-LIKE表达。(3)构建SlGGP-LIKE-GFP融合蛋白并瞬时转化本生烟幼苗,通过Confocal观察发现SlGGP-LIKE蛋白定位于细胞核。(4)构建了pET-SlGGP-LIKE原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功诱导SlGGP-LIKE蛋白表达,制备抗体,效价为1:300,并用于Western blot实验。(5)将SlGGP-LIKE基因的编码区连入含有35S启动子的pBI121载体,重组构建了SlGGP-LIKE的过表达和抑制表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄和烟草,获得反义转基因番茄植株和过表达SlGGP-LIKE的烟草植株。通过PCR、RT-qPCR以及Western杂交的方法对得到的转基因植株进行检测,结果表明成功获得了SlGGP-LIKE过表达和抑制表达的转基因番茄植株和转基因烟草植株。通过进一步对转基因植株的检测发现,转反义番茄AsA含量与野生型番茄相比明显下降,转正义烟草AsA含量升高了将近两倍。(6)通过检测反义株系抗坏血酸合成途径(L-半乳糖途径)中其他相关酶基因的表达量,发现位于SlGGP-LIKE上游的基因,如GPI和GME基因的表达上调。特别是GGP基因,表达量明显上调。相反的,在SlGGP反义植株中,SlGGP-LIKE表达量上调不如GGP基因明显。因此我们推测在L-半乳糖途径中,两个基因相比较,GGP的表达更为重要。(7)低温胁迫下,反义SlGGP-LIKE番茄生长受到抑制的程度更为严重,PSII最大光化学效率、净光合速率、P700的氧化状态和D1蛋白含量与WT植株相比下降的更为明显。并且反义植株积累了更多的活性氧,膜脂伤害程度更为严重,叶黄素循环的脱环氧程度更低。(8)用丁香假单胞病原菌侵染转基因反义番茄和WT植株后,病原菌对转基因植株的伤害程度明显小于WT植株。通过台盼蓝染色以及菌落数量统计结果,均说明转基因番茄对病原菌的抗性强于WT植株。病原菌侵染后,转基因植株出现明显的H2O2的快速累积的现象。通过RT-qPCR检测发现,抗病基因PR1和NPR1基因在转基因植株中表达量明显高于WT植株,同时转基因番茄株系中水杨酸合成途径关键基因ICS的表达量明显高于WT植株。这说明SlGGP-LIKE参与了抗病响应,并且是通过H2O2作为信号物质诱导的水杨酸合成途径增强了转基因番茄的病原菌抗性。(9)过表达SlGGP-LIKE明显提高了转基因烟草AsA含量,减少了转基因烟草在氧化胁迫下H2O2和O2?-的积累。与WT植株相比,转基因植株生长状况更好,叶圆片失绿更轻,并且具有相对较高的PSII最大光化学效率、净光合速率和D1蛋白含量。因此,过表达SlGGP-LIKE能够增强转基因烟草对氧化胁迫的抗性。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2;S641.2

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王淑芳,王峻岭,赵彦修,张慧;胆碱脱氢酶基因的转化及转基因番茄耐盐性的鉴定[J];植物生理学报;2001年03期
2 郑雨燕;凌均棨;麦穗;;变形链球菌表面蛋白多肽片段在转基因番茄中的表达[J];华西口腔医学杂志;2007年02期
3 赵春梅;张文彦;刘箭;;过量表达内质网小分子热激蛋白增强转基因番茄果实的耐冷藏性[J];西北植物学报;2011年01期
4 马庆虎,宋艳茹,魏玉凝,李跃东,侯林林;多聚半乳糖醛酸酶反义基因在转基因番茄中的表达[J];生物多样性;1995年01期
5 ;转基因番茄出世[J];广州化工;1996年01期
6 胡亚忱,徐洪伟;转基因番茄的快繁研究[J];吉林师范大学学报(自然科学版);2004年01期
7 张伟玉;杜长城;王一方;李建科;刘艳军;杨静慧;;转基因抗衰老番茄F2代果实品质研究[J];生物技术通报;2006年S1期
8 ;英国科学家培育出抗癌番茄[J];今日国土;2008年10期
9 赵淑珍,王昕,王革娇,张秀华,张春霞,杨希才,徐雷新,刘怡之,田波;由卫星互补DNA单体和双体基因构建的抗黄瓜花叶病毒的转基因番茄[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1990年07期
10 魏玉凝,李曜东,马庆虎,宋艳茹;表达多聚半乳糖醛酸酶反义RNA的转基因番茄分析[J];植物学报;1996年03期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 张岳;张洪霞;;抗旱、耐冷无选择标记基因转基因番茄的培育[A];2007中国植物生理学会全国学术会议论文摘要汇编[C];2007年
2 唐克轩;林娟;赵凌侠;任薇薇;李维;王国丰;林玲;孙小芬;;利用转基因番茄和生菜表达鲑鱼降钙素的研究[A];中国生物工程学会2006年学术年会暨全国生物反应器学术研讨会论文摘要集[C];2006年
3 徐鹤林;陆春贵;余文贵;杨荣昌;曹晓凤;朱玉贤;冻章良;;番茄ACC合成酶反义cDNA转化及转基因番茄果实贮藏生理特性研究[A];中国园艺学会成立70周年纪念优秀论文选编[C];1999年
4 张启发;;转基因农作物的安全性及管理[A];新世纪科技与湖北经济发展——2001首届湖北科技论坛论文集[C];2001年
5 于力;阎君;朱为民;;低温胁迫下番茄LeMPK3基因表达特性及功能分析[A];2013中国园艺学会设施园艺分会学术年会·蔬菜优质安全生产技术研讨会暨现场观摩会论文摘要集[C];2013年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郭飞;柑橘遗传图谱构建及类胡萝卜素代谢调控研究[D];华中农业大学;2015年
2 孟夏;番茄SlAV2基因的克隆、表达和功能分析[D];山东农业大学;2015年
3 杨东岳;番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因SlGGP-LIKE的功能分析[D];山东农业大学;2017年
4 谢丽娟;转基因番茄的可见/近红外光谱快速无损检测方法[D];浙江大学;2009年
5 叶志彪;乙烯形成酶反义基因转化番茄及耐贮藏品种的选育[D];华中农业大学;2000年
6 张余洋;转基因番茄标记基因剔除及翻译起始因子4E基因顺化植物的病毒抗性[D];华中农业大学;2006年
7 潘丽;口蹄疫病毒免疫原基因在番茄和拟南芥中的表达及转基因番茄动物免疫试验[D];中国农业科学院;2005年
8 贾庚祥;BADH基因转化番茄提高耐盐性的研究[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2002年
9 韩芹芹;番茄SlNAC3基因通过延迟果实软化和改变类胡萝卜素的合成调控果实成熟[D];华中农业大学;2011年
10 蒙姣荣;番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM3的克隆与功能鉴定[D];华南农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 尹蕾;双靶向RNAi提高番茄抗病毒复合侵染能力的研究[D];牡丹江师范学院;2016年
2 刘展;苹果HMGR1基因克隆及在番茄中的功能分析[D];山东农业大学;2016年
3 强晓敏;不同转基因番茄磷素利用率研究[D];西北农林科技大学;2012年
4 郭文文;转基因番茄对土壤生物学性质及养分吸收的影响[D];山东农业大学;2010年
5 刘泽洲;AtmiR399f在番茄中的异位表达及功能分析[D];山东农业大学;2011年
6 刘军霞;番茄抗坏血酸生物合成酶GME和MIOX的功能分析[D];华中农业大学;2009年
7 王双双;MhGAI2基因在番茄中的异位表达分析[D];山东农业大学;2010年
8 郭淑华;甜味蛋白Brazzein在番茄中的遗传转化研究[D];中国农业科学院;2005年
9 韩琪;防龋用转基因番茄中外源目的蛋白表达稳定性研究[D];遵义医学院;2011年
10 孙艳;组成型表达线粒体小分子热激蛋白基因对番茄抗冷性的影响[D];山东师范大学;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026