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《山东农业大学》 2017年
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KOR与B2R异源二聚体介导的细胞内信号转导途径及其作用的研究

季丙元  
【摘要】:κ型阿片受体(κ-opioid receptor,KOR)和缓激肽2型受体(bradykinin B2 receptor,B2R)都属于G蛋白偶联受体家族成员,二者及其配体强啡肽(dynorphin,DYN)和缓激肽(bradykinin,BK)广泛分布于心血管系统和中枢神经系统。目前,有关KOR和B2R两种受体相互作用的研究未见报道。本课题运用生物物理方法研究二者间的异源二聚化作用,以及形成异源二聚体后对细胞内信号转导途径的影响,探讨KOR/B2R异源二聚体在细胞内的信号转导机制及其在神经保护作用中的分子机制,为神经损伤等神经系统疾病的治疗和药物研发提供新的思路和实验依据。本课题利用pcDNA3.1-KOR和pcDNA3.1-B2R质粒建立了稳定表达KOR、B2R或KOR/B2R的HEK293细胞。pcDNA3.1-KOR和EGFP-B2R共转染HEK293细胞,进行免疫荧光染色,共聚焦扫描显微镜结果显示KOR与B2R在细胞中的分布高度一致,且主要定位于细胞膜。RT-PCR结果显示KOR和B2R均内源性表达于SH-SY5Y细胞,这些结果为下一步进行二聚体的研究奠定了基础。本研究构建了KOR-Rluc和B2R-mVenus两种重组质粒,共同或单独转染HEK293细胞。生物发光检测和荧光检测确保各组受体表达水平一致,BRET检测结果显示,KOR-Rluc与B2R-mVenus共转染组的BRET值与其它阴性对照组相比差异显著,表明KOR和B2R之间能够发生相互作用。在饱和实验中,固定供体KOR-Rluc的量不变,受体B2R-m Venus的量逐渐增加,结果显示,KOR-Rluc和B2R-mVenus共转染组的BRET值呈现双曲线形式增加,最终达到平台期,对照组pcDNA3.1-Rluc和B2R-mVenus共转染组以及mVenus和KOR-Rluc共转染组BRET值没有明显增加,是一种非特异性的线性关系。竞争性结合实验显示,随着未标记受体转染量的增加,两受体间的BRET值逐渐降低。BRET饱和实验和竞争性结合实验说明,KOR和B2R间的相互作用是特异的,而不是由受体过表达导致的分子间的随机碰撞引起的,排除了受体过表达引起的假阳性。FRET技术进一步证实了细胞中KOR和B2R间的相互作用。在共转染KOR-CFP和B2R-mVenus的细胞中,FRET信号明显强于受体单转组和阴性对照组。KOR-CFP和B2R-mVenus间的FRET现象可发生在CHO等不同类型的细胞中,表明二者的相互作用不受细胞类型的限制,没有细胞类型的偏向性。邻位连接分析技术(proximity ligation assay,PLA)更直观地证实,KOR和B2R可发生相互作用形成异源二聚体。本课题对camp、camp应答元件(campresponseelement,cre)、血清反应元件(serumresponseelement,sre)和camp应答元件结合蛋白(camp-responseelement-bindingprotein,creb)等信号分子进行了检测。与hek293-kor和hek293-b2r细胞相比,dyna(1-13)显著提高了hek293-kor/b2r细胞中camp的表达水平,而bk不能通过kor/b2r二聚体影响camp的表达。camp作为细胞内第二信使,通常是gαs蛋白下游信号中间分子,受gαs活化程度的影响。为研究二聚体和g蛋白间的偶联关系,实验采用gαs-rluc8、gαi2-rluc8或gαq-rluc8与kor-mvenus、b2r-mvenus或kor-mvenus和b2r共同转染hek293细胞,同时转染未标记的gβ1和gγ2蛋白亚基,进行bret分析。在dyna(1-13)刺激后,与单独表达kor或b2r的细胞相比,kor-mvenus和rluc8-gαs共转染组的bret信号显著增强,提示激动剂刺激后kor/b2r二聚体倾向于结合并激活gαs蛋白亚基。为检测kor和b2r二聚体对下游信号的影响,本研究运用双报告基因检测系统检测了细胞中cre和sre的活性。共转染组细胞中cre-luc的活性要显著高于kor或b2r单转染组,sre的活性显著低于kor单转染组,和对照组hek293细胞相比没有明显变化。实验显示,当激动剂dyna(1-13)刺激hek293-kor/b2r细胞时,kor和b2r间的异源二聚化作用增强了cre的活性,而cre的活性依赖于pka的激活。本实验进一步阐明了,kor/b2r异源二聚体能够和gαs结合进而增强cre的活性。通常,gpcr与gαs结合可激活腺苷酸环化酶,进而增强creb的磷酸化水平。为确定kor/b2r二聚体能否影响creb的磷酸化,在用激动剂dyna(1-13)处理后,westernblot对creb的活化水平进行了浓度依赖和时间依赖性检测。用浓度为10-7m的dyna(1-13)处理各组细胞0-60分钟,5分钟时,hek293-kor/b2r细胞中creb的活化水平有明显的增强,并随时间逐渐降低。在浓度依赖性实验中,当dyna(1-13)的浓度增强时,hek293-kor/b2r细胞中creb的磷酸化水平随着激动剂dyna(1-13)浓度的增加而逐渐增强。在sh-sy5y细胞中,creb的磷酸化水平同样表现出浓度依赖性增强。分别用pka抑制剂h89和plc抑制剂u73122对细胞进行预处理,只有hek293-kor/b2r细胞中磷酸化creb的表达要水平明显受到h89的抑制,而其它单转组未受到明显的影响。u73122未对共转染组creb的活性产生较为明显的影响。这充分说明,hek293-kor/b2r细胞中kor/b2r二聚体对creb的激活是通过gαs/camp/pka信号途径介导的,而非plc/pkc信号途径。为更有力地证实kor/b2r二聚体对creb磷酸化的影响,我们用shrna-kor或shRNA-B2R对SH-SY5Y细胞中KOR和B2R受体进行干扰。蛋白免疫印迹结果显示,KOR-shRNA和B2R-shRNA显著降低了SH-SY5Y细胞中KOR和B2R的表达,同时Dyn A(1-13)诱导的CREB的磷酸化水平明显降低。有趣的是,B2R的沉默同样降低了Dyn A(1-13)诱导的CREB磷酸化水平,这说明在SH-SY5Y细胞中,KOR和B2R是作为一个复合物发挥作用,在Dyn A(1-13)的刺激下可增强CREB磷酸化的表达。本实验通过多种方法证实,KOR和B2R能够在细胞内发生相互作用形成异源二聚体,并显著影响细胞内信号转导途径。为检测二聚体特异的信号转导对细胞功能的影响,我们利用CCK-8细胞活性分析系统对细胞增殖活性进行了分析。结果显示,Dyn A(1-13)能显著增强HEK293-KOR/B2R细胞的增殖,并呈现出剂量依赖效应,而HEK293-KOR和HEK293-B2R细胞的活性没有发生改变。如前所述,Dyn A(1-13)能显著增强人SH-SY5Y细胞中CREB的磷酸化,与此相对应,Dyn A(1-13)同样能显著促进SH-SY5Y细胞的增殖。本课题首次证明了KOR和B2R两种GPCR能组成性的相互作用形成异源二聚体,并能诱导产生新的细胞内信号转导途径。KOR/B2R异源二聚体介导的Gαs/cAMP/PKA信号通路的活化增强了CREB的磷酸化水平,促进了SH-SY5Y细胞的增殖。本研究初步阐明了KOR/B2R异源二聚体的信号转导机制及其在神经保护过程中的分子机制,为神经损伤等神经疾病的治疗和相关药物的设计提供了有价值的参考依据。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q257

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