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《山东农业大学》 2017年
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6K和P3N-PIPO蛋白调控烟草脉带花叶病毒复制和移动的分子机制

耿超  
【摘要】:马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是最大植物病毒属,包含200多种病毒。该属病毒寄主范围广泛,发生普遍,给作物生产带来严重损失。种植抗病品种是防治作物病毒病最为经济有效的方式。但目前生产中缺乏有效的抗病毒品种。植物病毒需要借助寄主蛋白来完成侵染循环。沉默或敲除病毒依赖的寄主蛋白可以使植物产生抗性。同时,理解病毒蛋白的分子功能以及病毒与寄主互作的分子机制是研发新的抗病毒策略的前提。本研究揭示了马铃薯Y病毒属的烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)在复制和移动两个病毒侵染关键环节中与寄主的相互作用机制。主要研究结果如下:1、病毒寄主蛋白复合体6K1-6K2-PsbO1调控病毒复制的分子机制:第一6kDa蛋白(6K1)包含一个保守的RSD基序。丙氨酸扫描实验证明该基序中任何一个氨基酸的改变都使TVBMV复制的复制水平下降。亚细胞定位实验证明TVBMV 6K1单独瞬时表达时分布在整个细胞之中,然而在病毒侵染过程中被招募到叶绿体并与TVBMV复制相关第二6 kDa蛋白(6K2)和复制酶核内涵体b共定位。6K1能与6K2在体内相互作用并被6K2招募到位于叶绿体的病毒复制复合体。免疫共沉淀和质谱鉴定表明本氏烟光系统II放氧复合体蛋白(Photosystem II oxygen evolution complex protein of Nicotiana benthamiana,NbPsbO1)存在于6K1-6K2复合体上。NbPsbO1能与TVBMV 6K2蛋白互作但不与6K1互作。利用病毒诱导基因沉默降低NbPsbO1基因的表达抑制了马铃薯Y病毒属病毒TVBMV和马铃薯Y病毒基因组RNA和外壳蛋白在植株中的积累量,但并不影响马铃薯X病毒属的马铃薯X病毒基因组RNA和外壳蛋白的积累量。光系统II放氧复合体的另外两个元件NbPsbP1和NbPsbQ1不能与6K2互作,而且沉默NbPsbP1和NbPsbQ1基因不影响TVBMV复制。2、病毒寄主蛋白复合体P3N-PIPO-CI-NbDREPP调控TVBMV细胞间移动的作用机制:TVBMV的PIPO结构域由60个氨基酸位点组成。含有由7个、20个或43个氨基酸组成的PIPO结构域的TVBMV突变体丧失了细胞间移动和系统侵染能力。但这些突变体的复制水平与野生型TVBMV一致。本氏烟发育调控质膜蛋白(Developmentally regulated plasma membrane protein of N.benthamiana,NbDREPP)能与TVBMV P3N-PIPO和柱状内涵体蛋白CI互作。沉默NbDREPP基因抑制了TVBMV的细胞间移动和系统侵染。NbDREPP自身定位在细胞壁上,能与胞间连丝定位蛋白PDLP1共定位,而且能与P3N-PIPO和CI共定位于胞间连丝。早期分泌途径抑制剂Brefeldin A处理或瞬时过表达显性负抑制突变体ADP核糖基化因子1(ADP-ribosylation factor1)-T31N或分泌相关ras超家族相关基因1b(Secretion-associated and ras superfamily-related gene1b)-H74L都破坏了NbDREPP的胞间连丝定位。微丝骨架抑制剂Latrunculin B处理或过表达显性负抑制突变体肌球蛋白XI-2尾部结构域也破坏了NbDREPP的胞间连丝定位。3、通过新一代测序技术比较野生型TVBMV和弱毒突变体侵染植物后的转录组变化揭示了TVBMV的症状形成机制。辅助成分蛋白酶(helper component proteinase,HCpro)是TVBMV的RNA沉默抑制子。通过定点突变技术在TVBMV侵染性克隆pCamTVBMV-GFP(pCamT-WT)HCpro编码区引入突变,获得突变体pCamTVBMV-GFP-HCproD198K+DE250-251(pCamT-HCm)。这些氨基酸的改变破环了HCpro的RNA沉默抑制活性而且使T-HCm在本氏烟上的症状明显减轻。我们通过转录组测序比较了T-WT和T-HCm侵染本氏烟1天、2天和10天后的基因表达变化。在T-WT或T-HCm侵染后1天和2天,与蛋白翻译相关的基因上调表达;而与脂质代谢以及胞内刺激反应相关基因下调表达。在病毒接种后10天,T-WT的侵染抑制了光合合成相关基因的表达,而T-HCm的侵染对光合合成相关基因无明显影响。T-WT的侵染使RNA沉默相关途径的关键基因DCL2、DCL4、RDR1和AGO1上调表达;而T-HCm的侵染对这些基因的表达无影响。T-WT的侵染也使水杨酸和乙烯信号途径中的相关基因上调表达,但使茉莉酸信号途径的相关基因下调表达。T-WT和T-HCm的侵染差异调控了生长素信号转导途径中相关基因的表达,这与TVBMV引起的矮化症状有关。综上所述,TVBMV劫持寄主因子NbDREPP和NbPsbO1用于自身细胞间移动和复制,DREPP和PsbO1可以作为抗TVBMV的新靶标。TVBMV的侵染干扰了植物的卡尔文循环、叶绿素代谢以及生长素信号转导途径导致植物产生褪绿和矮化症状。
【关键词】:马铃薯Y病毒属 病毒复制 病毒移动 寄主因子 互作
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S432.41
【目录】:
  • 符号说明6-10
  • 中文摘要10-12
  • Abstract12-15
  • 1 前言15-28
  • 1.1 植物RNA病毒的复制15-19
  • 1.1.1 病毒复制复合体生物起源15-16
  • 1.1.2 病毒复制复合体的组分16-19
  • 1.2 植物RNA病毒的移动19-23
  • 1.2.1 单一移动蛋白介导的核酸蛋白复合体细胞间移动20-21
  • 1.2.2 三基因组模块介导的核酸蛋白复合体细胞间移动21-22
  • 1.2.3 移动蛋白在胞间连丝形成管状结构介导病毒粒子细胞间移动22
  • 1.2.4 马铃薯Y病毒属病毒的细胞间移动22-23
  • 1.3 马铃薯Y病毒属病毒 6K1、6K2和P3N-PIPO的功能23-27
  • 1.4 转录组测序技术在植物病毒与寄主互作研究中的应用27-28
  • 1.5 本研究的目的和意义28
  • 2 材料与方法28-39
  • 2.1 植物和菌株材料28-29
  • 2.2 主要试剂29
  • 2.3 主要仪器29
  • 2.4 载体构建29-30
  • 2.5 RNA提取、反转录和核酸杂交30-31
  • 2.6 质粒小量提取31
  • 2.7 胶回收31
  • 2.8 大肠杆菌转化31-32
  • 2.9 农杆菌转化32
  • 2.10 荧光定量PCR32
  • 2.11 体内蛋白复合体纯化32-33
  • 2.12 质谱分析33
  • 2.13 Western blot分析33-34
  • 2.14 酵母双杂交34-35
  • 2.14.1 酵母感受态制备34
  • 2.14.2 酵母双杂交验证两个蛋白之间的互作34-35
  • 2.15 免疫共沉淀35
  • 2.16 双分子荧光互补35-36
  • 2.17 化学抑制剂处理实验36
  • 2.18 体视荧光显微和共聚焦显微观察36-37
  • 2.19 病毒接种37
  • 2.20 病毒诱导的基因沉默37-38
  • 2.21 RNA沉默抑制实验38
  • 2.22 RNAseq数据获取及分析38-39
  • 3 结果与分析39-88
  • 3.1 6K1-6K2-NbPsbO1蛋白复合体参与调控TVBMV复制39-55
  • 3.1.1 6K1 RSD基序的突变抑制TVBMV复制39-41
  • 3.1.2 TVBMV 6K2招募 6K1到病毒复制复合体41-42
  • 3.1.3 6K2能在体内与NbPsbO1相互作用42-44
  • 3.1.4 降低NbPsbO1表达抑制TVBMV复制44-46
  • 3.1.5 降低NbPsbO1表达抑制马铃薯Y病毒但不抑制马铃薯X病毒侵染46-48
  • 3.1.6 6K2蛋白Asn16、Asp23和Gly33是参与调控TVBMV复制和6K2及与NbPsbO1互作的关键位点48-53
  • 3.1.7 光系统II放氧复合体蛋白元件PsbP1和PsbQ1不与6K2互作且也不参与TVBMV复制53-55
  • 3.2 NbDREPP参与TVBMV移动并通过早期分泌途径和微丝骨架转运到胞间连丝55-73
  • 3.2.1 PIPO结构域的长度决定了TVBMV突变体在细胞间的移动能力55-59
  • 3.2.2 移动缺陷型突变体能通过突变恢复系统侵染能力59-60
  • 3.2.3 TVBMV P3N-PIPO和CI蛋白能与NbDREPP互作60-63
  • 3.2.4 NbDREPP参与了TVBMV细胞间移动63-65
  • 3.2.5 NbDREPP与P3N-PIPO和CI共定位于胞间连丝65-67
  • 3.2.6 NbDREPP能通过早期分泌途径转运到胞间连丝67-69
  • 3.2.7 微丝骨架和肌球蛋白XI-2 参与了NbDREPP的细胞内转运69-71
  • 3.2.8 早期分泌途径参与TVBMV P3N-PIPO胞间连丝定位71-73
  • 3.3 烟草脉带花叶病毒野生型和弱毒突变体侵染本氏烟后引起的转录组变化73-88
  • 3.3.1 烟草脉带花叶病毒野生型和弱毒突变体在本氏烟上引起的症状73
  • 3.3.2 T-WT或T-HCm侵染本氏烟的差异基因表达分析73-75
  • 3.3.3 差异表达基因归类75-77
  • 3.3.4 TVBMV的侵染抑制了光合合成反应相关基因的表达77-80
  • 3.3.5 TVBMV侵染改变了RNA沉默相关基因的表达80-84
  • 3.3.6 TVBMV的侵染改变激素信号途径相关基因的表达84-88
  • 4 讨论88-97
  • 4.1 6K1-6K2-NbPsbO1蛋白复合体调控TVBMV复制88-90
  • 4.2 NbDREPP参与TVBMV的移动并通过早期分泌途径和肌动肌球蛋白系统转运到胞间连丝90-95
  • 4.2.1 NbDREPP能与P3N-PIPO和CI共同互作促进TVBMV细胞间移动90-92
  • 4.2.2 NbDREPP通过早期分泌途径和肌动肌球网络定位到胞间连丝92-93
  • 4.2.3 TVBMV P3N-PIPO蛋白的PIPO结构域具有长度多态性93
  • 4.2.4 6K蛋白和P3N-PIPO蛋白介导TVBMV复制和移动的模型93-95
  • 4.3 TVBMV野生型和弱毒突变体侵染本氏烟后引起的转录组变化95-97
  • 4.3.1 T本氏烟光合合成相关基因的差异表达与T-WT引起褪绿症状形成的关系95-96
  • 4.3.2 T-WT和T-HCm的侵染差异调控RNA沉默96
  • 4.3.3 T-WT和T-HCm的侵染差异调控植物激素信号转导途径相关基因的表达96-97
  • 5. 结论97-98
  • 参考文献98-110
  • 附表110-113
  • 致谢113-114
  • 攻读博士学位期间发表论文情况114

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