收藏本站
《山东农业大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

水环境中产ESBL肠杆菌耐药质粒在小鼠肠道内水平转移的分子机理

张红娜  
【摘要】:合理使用抗生素能够治疗人类和动物的感染性疾病,然而临床中滥用和过度使用抗生素加剧了耐药菌的出现,甚至“超级细菌”的产生。超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)主要是质粒编码的一类酶,能够水解青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素,但不能水解头霉素类(如头孢西丁、头孢替坦)或碳青霉烯类,可被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。全球流行的ESBLs主要包括SHV型、TEM型和CTX-M型。CTX-M型是目前最主要的β-内酰胺酶类型。ESBLs主要在肠杆菌中发现,肠杆菌是人和动物肠道内正常菌群,也是院内和社区感染的重要病原体。人和动物源的耐药菌通过排放最终进入到水环境中,其耐药基因可能在水环境的细菌之间进一步扩散。水被认为是耐药基因重要的存储库。因此,一旦产ESBL肠杆菌通过污染的食物或饮用水进入到人和动物肠道内,很可能导致耐药基因在人和动物体内传播,甚至造成严重的感染。质粒在肠杆菌之间具有潜在的转移能力,很可能导致超级毒力或耐药菌株出现,在耐药性的进化和散播过程中起着重要的作用,但至今其转移机制尚不明确。为了了解不同水环境中产ESBL肠杆菌的流行情况及其来源,以及携带ESBLs的耐药质粒在小鼠肠道内水平转移的分子机理,我们开展了以下研究。1.泰安农村井水中产ESBL肠杆菌的流行及特点为了解泰安农村井水中产ESBL肠杆菌的流行及特点。从4/100(4%)个采样井中,共分离到10株产ESBL肠杆菌,包括9株大肠杆菌和1株肺炎克雷伯菌。ESBL基因型结果显示9株菌为CTX-M-15,1株菌为CTX-M-27。5/8株CTX-M-15产ESBL大肠杆菌属于ST10,在人粪便中经常检测到。值得注意的是,仅有1株CTX-M-27型大肠杆菌的多位点序列分型属于B2:131(ST131),可能与人类和动物的严重感染有关。2.馆陶地区农村蓄水池中产ESBL肠杆菌的多重耐药性对馆陶地区农村蓄水池中产ESBL肠杆菌进行分离并分析其特点。采集的30个蓄水池中,有5个(16.7%)分离检测到产ESBL肠杆菌。本研究中分离到66株ESBL表型阳性的非重复性菌株。菌种鉴定结果为42株为大肠杆菌,17株为肺炎克雷伯菌,4株植生拉乌尔菌、3株阴沟肠杆菌。20株菌含有单一的bla基因,包括CTX-M型(17株)、TEM(2株)和SHV(1株);46株菌同时含有两种或三种bla基因。所有产ESBL肠杆菌均表现多重耐药性。这些结果表明馆陶地区的农村蓄水池已被产ESBL肠杆菌严重污染。3.泰安黄前水库中产esbl耐热肠杆菌的耐药性及整合子特点我们以产esbl耐热大肠菌(extended-spectrumβ-lactamases-producingthermotolerantcoliforms,esbl-tc)为指示菌,对泰安黄前水库中分离的esbl-tc的耐药性、bla基因型、整合子(1、2、3类)及基因盒的特点进行分析。共分离到96株非重复性esbl-tc菌株,esbl基因包括blactx-m-14(n=47),blactx-m-15(n=27),blactx-m-55(n=18),blashv-12(n=4),blactx-m-3(n=3),andblactx-m-123(n=1)。其中83株含有1类整合子(86.5%),2株含有2类整合子,整合子基因盒的大小在0.2kb至3.2kb之间。该结果表明,黄前水库已被esbl-tc严重污染,成为耐药基因的储存器。4.泰安健康农村居民中粪便携带ctx-m型产esbl肠杆菌的高流行率及风险因素分析为了解泰安地区农村健康居民粪便中ctx-m型esbl肠杆菌科细菌的携带情况及相关风险因素。从农村居民中共收集620份粪便样本,筛选ctx-m阳性肠杆菌,并应用标准统计方法对粪便携带的相关风险因素进行分析。458株携带ctx-m的肠杆菌(458/620,73.9%)分离于不同的人,最主要的基因型为ctx-m-9组(303/458,66.2%)。携带ctx-m基因的肠杆菌中,主要为大肠杆菌(403/458,88%)和肺炎克雷伯菌(26、458、5.7%)。所有ctx-m阳性菌株都对氨苄西林、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松耐药,但都对比阿培南、亚胺培南、美罗培南敏感。多变量逻辑回归模型分析结果:受正规教育(or2.321;95%ci1.302–3.768;p=0.039),过去6个月内的住院情况(or1.753;95%ci1.127–2.584;p=0.031)和过去6个月内抗生素的使用(or1.892;95%ci1.242–2.903;p=0.034),这三个变量与ctx-m型产esbl阳性菌株携带者具有显著相关性(x2=21.21;df=3;p0.001)。泰安市健康农村居民的粪便携带ctx-m型产esbl肠杆菌粪便的流行率高,主要与近期抗生素的使用和住院情况有关。5.从猪和养殖工作人员分离的产esbl大肠杆菌的特性食品性动物一直被认为产esbl大肠杆菌的存储器。为分析和比较猪源与猪场工作人员中携带的产esbl大肠杆菌的特点,从4个育肥猪场中采集60头猪的肛门棉拭子(15个样品/猪场),并采集40个猪场工作人员的直肠棉拭子(10人/猪场)。从以下几个方面对分离的产esbl大肠杆菌进行分析:esbl基因型,耐药谱,eric和多位点序列分型。自60份猪肛门棉拭子中分离到34株产esbl阳性大肠杆菌,20.0%(8/40份)的工作人员棉拭子为产esbl大肠杆菌阳性。更重要的是,同一猪场内猪源和工作人员中分离到的产esbl大肠杆菌菌株具有相同的β-内酰胺酶基因、耐药谱、eric型以及相同的st型。结果表明在动物与人之间可能存在产esbl大肠杆菌的传播。6.esbls耐药质粒全序列分析编码esbls基因通常位于质粒上,并通过接合、转座作用转移和传播。我们挑选了一株水源携带ctx-m-15基因的大肠杆菌w121,进行体外耐药质粒接合转移,并对质粒dna全序列分析。携带的ctx-m-15耐药性质粒tp采用鸟枪法构建文库方法进行dna测序并利用生物信息学方法分析了其编码基因和结构。质粒tp全长为94495bp,属于inci1质粒不相容性分组。质粒全序列上共含有116个预测基因,仅携带两个已知耐药基因blactx-m-15和blatem-1。tp的基本结构与质粒r64非常的相似,骨架之间共线性主要位于转移区域,并且同样含有大肠杆菌素ib基因。耐药质粒tp可看作由转座子tn3介导的isecp1-blactx-m-15相关元件嵌合体。类似tp质粒上两个不同β-内酰胺酶基因的同时转座,会导致耐药基因的广泛传播,具有重要的公共卫生学意义,需进一步研究。7.水源产esbl大肠杆菌在小鼠肠道内滞留应用小鼠肠道定植模型,检测水源产esbl大肠杆菌耐药基因在体内的定植能力以及抗生素对产esbl大肠杆菌在肠道内滞留的影响。小鼠接触的饮用水污染浓度越高,耐药菌在肠道内滞留的时间越长,但最终会低于检测水平。在抗生素(头孢菌素)处理的小鼠中,水源大肠杆菌在肠道内定植水平为108cfu/g;未给予抗生素的小鼠中,由于小鼠肠道固有菌群的定植拮抗作用,耐药菌迅速下降至检测限以下,但再给予抗生素治疗后,耐药菌直接达到可检测水平并上升至108cfu/g粪便。此外,在小鼠肠道内定植期间可检测到耐药质粒的转移,blactx-m和blatem基因可同时转移至肠道固有肠杆菌中。总之水源耐药大肠杆菌能够很好地在肠道内定植,携带的质粒在体内具有转移能力。抗生素治疗有利于耐药菌的选择生长及肠道内的定植,增强了耐药基因库,最终提高了耐药基因的传播风险。8.水源产esbl大肠杆菌耐药基因在炎症小鼠肠道内的水平转移首先建立小鼠肠道炎症模型。在沙门氏菌感染的链霉素处理小鼠模型中,小鼠肠道炎症促进了供体菌(108-1011cfu/g粪便)和受体菌(108-1010cfu/g粪便)在肠道内的共同大量增值。在大量增值的状态下,检测供体菌与受体菌之间质粒tp的转移接合率,结果发现接合菌(tcs)几乎等于受体菌在肠道内的水平,且转移率高达近100%,显著高于正常肠道组。说明在5dpi几乎所有的受体菌都接受了质粒成为tcs。在正常肠道小鼠模型中,由于肠道内定植拮抗,供体菌、受体菌的水平显著低于肠道炎症组小鼠,接合菌的水平也远远低于受体菌。总之,炎症引发肠道内肠杆菌的大量繁殖,使得供体菌和受体菌的密度比正常哺乳动物肠道内提高了100多倍。这促进了不同肠杆菌之间遗传物质的重排和转移,表明感染的病人体内更容易发生质粒编码的耐药因子的扩散转移(如ESBL)。9.水源产ESBL大肠杆菌在小鼠肠道内质粒水平转移的分子机制哺乳动物肠道内含有大量的微生物菌群,这些微生物菌群可以通过质粒水平转移的方式与入侵微生物之间进行基因的交换,导致超级毒力或耐药的菌株出现,但至今其转移机制尚不明确。为了更确切地证明是否在水源大肠杆菌(E.coli W121)与肠道固有大肠杆菌之间发生了质粒水平转移,以及从分子生物学角度探讨其水平转移的机制。首先利用生物信息学将Tp质粒与固有大肠杆菌(EC615)所接受的质粒比较,发现EC615质粒(Tpinv)与Tp质粒同源性为99%,唯一的区别在于shufflon区域的一个重复序列发生了倒置。利用基因敲除技术,结果发现整个转移过程中,shufflon并不起关键作用。再次对质粒进行分析,我们发现大肠杆菌接受外源质粒的主要原因是基于“利益驱动”--大肠菌素(cib)。因此,本研究不仅成功建立了质粒在肠杆菌间水平转移的动物模型,而且找到了其转移的核心贡献因素--大肠菌素。
【关键词】:水环境 产ESBL肠杆菌 CTX-M 质粒 水平转移机制
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.61;R378
【目录】:
  • 中文摘要11-15
  • ABSTRACT15-20
  • 1 前言20-44
  • 1.1 肠杆菌20-22
  • 1.1.1 大肠杆菌20-21
  • 1.1.2 克雷伯氏菌21-22
  • 1.2 抗生素22-25
  • 1.2.1 β-内酰胺类抗生素22-25
  • 1.3 耐药性25-27
  • 1.3.1 耐药性的类型25
  • 1.3.2 耐药机制25-26
  • 1.3.3 抗性的遗传特点26-27
  • 1.4 ESBL的定义与分类27-34
  • 1.4.1 ESBL类型29-34
  • 1.5 ESBL检测方法34-36
  • 1.5.1 双纸片扩散法34
  • 1.5.2 表型确证实验34
  • 1.5.3. ESBL E-test法34-35
  • 1.5.4 琼脂加克拉维酸法35
  • 1.5.5 自动化的方法35
  • 1.5.6 分子检测方法35-36
  • 1.6 治疗方法的选择36-37
  • 1.7 关于携带ESBL基因的质粒及其宿主菌株分型特点的流行病学方法37-38
  • 1.7.1 大肠杆菌的系统分型和ESBL分型37
  • 1.7.2 多位点序列分型 (MLST)37-38
  • 1.7.3 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 分型38
  • 1.7.4 质粒不相容性或质粒复制子类型38
  • 1.8 质粒编码耐药性:获得并转移耐药基因38-41
  • 1.8.1 移动基因元件39
  • 1.8.2 细菌质粒39-41
  • 1.9 水环境作为耐药基因的储存器41-43
  • 1.10 本研究的目的与意义43-44
  • 2 材料与方法44-72
  • 2.1 试验材料44-46
  • 2.1.1 所用菌株44
  • 2.1.2 试验动物44
  • 2.1.3 主要试剂44-46
  • 2.1.4 主要仪器46
  • 2.2 试验方法46-72
  • 2.2.1 泰安农村井水中产ESBL肠杆菌的流行及特点46-50
  • 2.2.2 馆陶地区农村蓄水池中产ESBL肠杆菌的多重耐药性特点50-51
  • 2.2.3 泰安黄前水库中产ESBL耐热肠杆菌(ESBL-TC)的耐药性及整合子特点51-56
  • 2.2.4 泰安健康农村居民中粪便携带CTX-M型产ESBL肠杆菌的流行率及风险因素分析56-57
  • 2.2.5 养殖场中猪和工作人员的产ESBL大肠杆菌的特性57-59
  • 2.2.6 多重耐药性质粒Tp全序列分析59-60
  • 2.2.7 水源产ESBL肠杆菌在小鼠肠道内滞留60-62
  • 2.2.8 水源产ESBL肠杆菌耐药基因在炎症肠道内转移62-64
  • 2.2.9 促进耐药质粒水平转移的分子机理64-72
  • 3 结果与分析72-103
  • 3.1 泰安农村井水中产ESBL肠杆菌的流行及特点72-74
  • 3.1.1 农村井水中产ESBL肠杆菌的分离72
  • 3.1.2 产ESBL肠杆菌的耐药性72
  • 3.1.3 ESBL基因72-73
  • 3.1.4 系统分型与MLST73-74
  • 3.2 馆陶地区农村蓄水池中产ESBL肠杆菌的多重耐药性74-76
  • 3.2.1 产ESBL肠杆菌的分离74-75
  • 3.2.2 产ESBL肠杆菌的耐药特点75
  • 3.2.3 产ESBL肠杆菌bla基因特点75-76
  • 3.3 泰安黄前水库中产ESBL耐热肠杆菌 (ESBL-TC) 的耐药性及整合子特点76-80
  • 3.3.1 ESBL-TC的分离76-77
  • 3.3.2 耐药谱77
  • 3.3.3 β-内酰胺酶基因77-78
  • 3.3.4 整合子和基因盒的特点78-80
  • 3.4 泰安健康农村居民中粪便携带CTX-M型产ESBL肠杆菌的高流行率及风险因素分析80-83
  • 3.4.1 调查结果80-81
  • 3.4.2 CTX-M基因81-82
  • 3.4.3 耐药特点82
  • 3.4.4 统计分析82-83
  • 3.5 从猪和养殖工作人员分离的产ESBL大肠杆菌的特性83-85
  • 3.5.1 猪与猪场工作人员中产ESBL大肠杆菌的分离情况83
  • 3.5.2 耐药特点83
  • 3.5.3 β-内酰胺酶基因的特点83-84
  • 3.5.4 ERIC和MLST84-85
  • 3.6 多重耐药性质粒TP全序列分析85-90
  • 3.6.1 质粒的提取85
  • 3.6.2 耐药基因的转移in vitro85-87
  • 3.6.3 质粒Tp的分析87-90
  • 3.6.4 转座区域序列分析90
  • 3.7 水源产ESBL肠杆菌在小鼠肠道内滞留90-94
  • 3.7.1 连续饮用污染水,产ESBL大肠杆菌在肠道内的滞留90-92
  • 3.7.2 抗生素对产ESBL大肠杆菌在肠道内滞留的影响92
  • 3.7.3 持续抗生素治疗期间耐药菌在肠道内的定植92-93
  • 3.7.4 固有肠道接合菌的特点93-94
  • 3.8 水源产ESBL肠杆菌耐药基因在炎症肠道内转移94-96
  • 3.8.1 鼠伤寒沙门氏菌肠道炎症模型的建立94-95
  • 3.8.2 肠道炎症小鼠肠道内的耐药基因转移95-96
  • 3.9 促进耐药质粒水平转移的分子机理96-103
  • 3.9.1 固有大肠杆菌EC615质粒的分析96-97
  • 3.9.2 E. coli W121 Tp?shf缺失株的构建97-100
  • 3.9.3 shufflon基因在质粒转移中的作用100-101
  • 3.9.4 E. coli W121 Tp?cib缺失株的构建101
  • 3.9.5 cib对质粒粒接合转移的影响101-103
  • 4 讨论103-113
  • 4.1 泰安农村井水中产ESBL肠杆菌的流行及特点103-104
  • 4.2 馆陶地区农村蓄水池中产ESBL肠杆菌的多重耐药性104-105
  • 4.3 泰安黄前水库中产ESBL耐热肠杆菌的耐药性及整合子特点105-106
  • 4.4 泰安健康农村居民中粪便携带CTX-M型产ESBL肠杆菌的高流行率及风险因素分析106-107
  • 4.5 从猪和养殖工作人员分离的产ESBL大肠杆菌的特性107-108
  • 4.6 多重耐药性质粒TP全序列分析108-109
  • 4.7 水源产ESBL肠杆菌在小鼠肠道内滞留109-111
  • 4.8 水源产ESBL肠杆菌耐药基因在炎症肠道内转移111
  • 4.9 促进耐药质粒水平转移的分子机理111-113
  • 4.9.1 ?shufflon111-112
  • 4.9.2 ?cib112-113
  • 5 结论113-114
  • 6 参考文献114-133
  • 7 致谢133-134
  • 8 博士在读期间发表的论文134-135
  • 获奖情况135

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 刘朝晖;王汉平;杨银梅;左斌;叶慧芬;;广州地区产ESBL肺炎克雷伯菌SHV型质粒的分子流行病学调查[J];中华微生物学和免疫学杂志;2006年10期
2 马佳毓,张文莉,付英梅,赵月辉,叶杨芹;产ESBL克雷伯菌与大肠埃希菌质粒分布的初步研究[J];微生物学杂志;2003年02期
3 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 傅爱玲;李希华;;ESBL菌株在检测报告中应注意的问题[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
2 王荣芳;;ESBL~+肺炎患儿的临床护理[A];全国内科护理学术交流暨专题讲座会议、全国心脏内、外科专科护理学术会议论文汇编[C];2006年
3 沈丽珍;陈洪敏;陈素菜;李坤;;ESBL显色培养基的显色评价[A];2009年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2009年
4 ;Multiple genes encoding fluoroquinolone resistance co-located with ESBL genes in non-typhoidal salmonella isolated from food producing animals[A];中国药理学会第十一届全国化疗药理学术研讨会论文集[C];2012年
5 罗燕萍;张秀菊;田芳;潘光娟;沈定霞;;产ESBL肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的分布及不同来源的ESBL耐药性[A];中华医院管理学会第十一届全国医院感染管理学术年会论文汇编[C];2004年
6 Lin Liu;Xiangyan Zhang;Xiaorong Wang;Shuchang An;Yuqian Li;Zhangcheng Gao;;Genetic Environment and Promoter Sequences of the ESBL-producing Klebsiella pneumoniae Isolates from Patients with Lower Respiratory Infection in Multiple Medical Centers in China[A];中华医学会呼吸病学年会——2013第十四次全国呼吸病学学术会议论文汇编[C];2013年
7 贺爱民;黄荣平;陈文萍;刘空前;;细菌耐药菌株检测[耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和超广谱b内酰氨酶(ESBL)菌株的检测]及药敏分析讨论[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
8 张文利;沈定霞;李星萍;罗燕萍;刘军;王新玉;施星海;;产酸克雷伯菌ESBL与AmpC酶耐药表型及基因型研究[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
9 原英;孙宏莉;王辉;宁永忠;徐英春;谢秀丽;;β内酰胺类抗生素对产CTX-M型超广谱β内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的接种效应[A];中国医院协会第十三届全国医院感染管理学术年会论文汇编[C];2006年
10 张文利;;产酸克雷伯菌ESBL与AmpC酶耐药表型及基因型研究[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 张敏;抗菌不成反致感染[N];医药经济报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 高丽丽;猪源产ESBL大肠杆菌的扩散及膨润土促其耐药基因转移机制的研究[D];山东农业大学;2015年
2 张红娜;水环境中产ESBL肠杆菌耐药质粒在小鼠肠道内水平转移的分子机理[D];山东农业大学;2017年
3 陈浩;水中产ESBL耐热大肠菌及耐药基因在小鼠肠道中的转归研究[D];第三军医大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前5条
1 陈风军;ESBL阳性的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对常用抗生素的耐药性研究[D];山东大学;2015年
2 王彬婷;鸡源大肠杆菌ESBL和PMQR基因流行分布及其传播特性研究[D];安徽农业大学;2014年
3 杜柯凝;新生儿病房ESBL菌感染状况的分析及预防[D];吉林大学;2012年
4 郭业彬;水中产ESBL大肠埃希菌bla CTX-M耐药基因转移及在烧伤伤口定殖实验研究[D];第三军医大学;2011年
5 Shamira Pem;大连市儿童医院住院患儿咽部阴性杆菌的携带状况分析[D];大连医科大学;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026