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《河南科技大学》 2017年
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鼠伤寒沙门菌ΔsodA缺失株的构建及其对巨噬细胞自噬的影响

张建康  
【摘要】:鼠伤寒沙门菌作为病原菌,在入侵宿主体内之后会遭遇到宿主出于免疫保护而形成的高活性氧(ROS)内环境。过量的ROS会对生物体的DNA、蛋白质和脂类等产生毒害作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)作为唯一可以清除超氧阴离子(·O2-)的抗氧化酶系成员,是细胞抵御ROS胁迫的第一道防线。已有研究表明,SOD参与到细菌的生长、菌膜生成、毒力等方面,但是对于其在鼠伤寒沙门菌中的功能研究,迄今为止还未见报道。因此本实验通过Red重组系统,构建了鼠伤寒沙门菌SM52ΔsodA缺失株和SM52CΔsodA互补株,对其生物学特性以及对巨噬细胞自噬的影响进行探讨,并且表达了SodA蛋白,对其酶学性质进行研究。为进一步研究sodA基因的功能以及在细胞自噬过程中的作用奠定良好基础。主要内容如下:1.鼠伤寒沙门菌ΔsodA缺失株的构建及生物学特性研究利用Red同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌sodA基因缺失株SM52ΔsodA以及互补株SM52CΔsodA,并对其生长速度、抗氧化胁迫、运动性、菌膜形成、耐环境压力(酸、碱、渗透压、血清)、ROS测定、酶活性等生物学特性进行研究。结果显示,SM52ΔsodA以及SM52CΔsodA构建成功。SM52ΔsodA缺失株在生长速度、抗氧胁迫、SOD酶活性、菌膜形成、耐血清方面相较于SM52、SM52CΔsodA下降明显;SM52ΔsodA在流动性、耐酸、耐碱、耐高渗透压方面无变化;SM52ΔsodA胞内外ROS含量显著高于SM52与SM52CΔsodA。2.鼠伤寒沙门菌超氧化物歧化酶sodA基因的表达及酶学性质研究利用原核表达系统构建了p ET-28a-sodA表达载体,经SDS-PAGE电泳鉴定实现了高效表达。过镍柱将SodA蛋白纯化之后对其酶学性质进行研究。结果显示SodA蛋白分别在40℃、乙醇体积分数为0、PH=7.0时到达最大活性,随着条件的变化,活性逐次降;其热稳定性较一般,80℃保温1h,活性仅剩21%;抑制剂实验中,SodA蛋白对SDS、氯仿-乙醇敏感,对H2O2不敏感;Mn2+、Zn2+、Cu2+对SodA蛋白活性促进效果最明显,Fe3+抑制效果最明显,Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、K+对蛋白活性无影响;SodA蛋白催化邻苯三酚的Vmax为2.03 U/min,Km为0.801 mmol/L。3.鼠伤寒沙门菌sodA基因对巨噬细胞自噬的影响将SM52、SM52ΔsodA、SM52CΔsodA感染鼠巨噬细胞RAW264.7后,应用荧光共聚焦观察LC3-Ⅱ变化;以及蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测不同时间点自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62含量的变化;观察不同时间点胞内活菌数量变化。荧光共聚焦结果显示,在细胞与细菌共培养1 h后,SM52ΔsodA感染组胞内LC3-Ⅱ的点状聚集数量明显高于SM52、SM52CΔsodA组(p0.05);WB结果显示,在细胞与细菌共培养1 h后,SM52ΔsodA感染组的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达量都比SM52、SM52CΔsodA组明显上升(p0.05),p62蛋白表达量下调明显,共培养2 h和3 h之后没有明显变化。活菌计数CFU结果显示,在共培养1 h之后,三组活菌数量无明显差异,随着时间延长到2 h和3 h后,SM52、SM52CΔsodA感染组胞内活菌数明显高于SM52ΔsodA感染组(p0.05)。以上结果显示sodA对发生在细菌细胞共作用早期的自噬有抑制作用,利于携带sodA基因的宿主菌在细胞内的存活。
【学位授予单位】:河南科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.61

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