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《河南科技大学》 2017年
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酵母双杂交系统筛选猪流行性腹泻病毒N蛋白互作宿主蛋白及N蛋白抗原表位鉴定

王忠泽  
【摘要】:猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪小肠细胞致使细胞死亡脱落从而引起的急性传染病,主要临床症状是水样腹泻、呕吐,对7日龄以内哺乳仔猪尤为易感。自2010年以来,以变异PEDV为主要病原体的PED在我国爆发,并迅速席卷全国及周边亚洲国家,给养猪业带来巨大的经济损失。PEDV为典型的单股正链RNA冠状病毒,与其他冠状病毒一样具有四个结构蛋白分别为纤突(Spike,S)蛋白、膜(Membrane,M)蛋白、小膜蛋白(Envelope,E)和核衣壳(Nucleocapsid,N),其中N蛋白是一个重要的结构蛋白,并且高度保守,因此筛选PEDV N蛋白与宿主细胞的互作蛋白,以及筛选针对N蛋白抗原表位,对于探寻PEDV的致病机制和特异性新型疫苗研究等提供帮助。本实验研究内容及结果如下:(1)为了获得与PEDV N蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究构建猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的重组载体p GBKT7-N,以其作为诱饵质粒,采用酵母双杂交方法,经过两次缺失培养基筛选,从猪肺泡巨噬细胞cDNA文库中筛选出与N蛋白相互作用的10个阳性克隆;将阳性克隆的序列与NCBI数据库中序列比对,结果显示对应着6种蛋白,分别为FTH1、LGALS3、CORO1C、SNRPG、KRTAP5-3和ZNF598,其中LGALS3和SNRPG两种蛋白可能与病毒增殖及凋亡有关,具有进一步研究价值,因此对这两种蛋白进行了回返、自激活和Co-IP实验验证,证实LGALS3和SNRPG蛋白确实与N蛋白存在特异的相互作用且排除了假阳性的可能。本研究为进一步研究猪流行性腹泻病毒N蛋白的功能及病毒的致病机制奠定了基础。(2)为了筛选和鉴定N蛋白的抗原表位核心区域,本实验将N基因截短为4个相互重叠的DNA片段N1、N2、N3、N4,将其分别克隆到质粒pCold I中,构建出4个重组质粒pCold I-N1、pCold I-N2、p Cold I-N3、pCold I-N4,通过IPTG诱导,进行分段融合蛋白原核表达;将表达的分段蛋白再经Western blot实验验证,结果显示只有N1(1-126aa)、N2(107-230aa)与N蛋白单克隆抗体反应,说明N蛋白的抗原表位区域在N1-N2(1-230aa)区域。同样的方法与策略,将N1-N2(1-230aa)区域截短为10个相互重叠的DNA片段A1、A2、A3、A4、A5、A6、B1、B2、B3、B4,将其分别克隆到质粒pCold TF中,构建出10个重组质粒,IPTG诱导,进行分段融合蛋白原核表达;将表达蛋白进行Western blot实验验证,结果显示A1(1-190aa)、A2(1-150aa)和B1(1-140aa)能与N蛋白单克隆抗体反应,而其他分段蛋白不反应,可以确认N蛋白的抗原表位在107-140aa区域。本研究确定的N蛋白抗原表位为以后建立特异性病毒诊断方法奠定了基础。
【学位授予单位】:河南科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.651

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