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《湖北中医药大学》 2017年
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基于cDNA文库的毛喉鞘蕊花CPS基因的克隆分析及多效唑促进isoforskolin合成机制研究

方颖  
【摘要】:毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii(Willd.)Briq.)系唇形科(Labiatae)鞘蕊花属(Coleus Lour.)草本植物,主产印度、巴基斯坦、斯里兰卡、阿拉伯半岛南部等热带和亚热带国家。该植物在我国云南、广东、福建、台湾等地亦稀有分布,被植物学家界定为珍稀植物。毛喉鞘蕊花药材名为鞘蕊苏,收载于《中国植物志》66卷和《云南省药品标准》,民间用于治疗哮喘、咳嗽等疾患,疗效显著,被称为“万灵药”;现代科学研究表明,该植物药中含有的半日花烷型二萜类化合物具有激活腺苷酸环化酶、强心、降压、抗肿瘤等广泛的药理作用。鉴于毛喉鞘蕊花药用植物的独特的药效作用,本课题组与湖北福人药业公司产学研结合,开发了中药新品种--“鞘蕊苏胶囊”,该药物已经获得中药新药生产批件(批件号:2011S00365)。为了保护野生毛喉鞘蕊花稀有植物的生态环境,本实验室湖北福人药业公司合作,从云南会泽县移植毛喉鞘蕊花至湖北通城县实施规范化种植研究,以期解决“鞘蕊苏胶囊”产业化的原料药材大量需求。本论文首先采用分子生物学研究方法对毛喉鞘蕊花二萜类化合物合成酶基因克隆和调控进行了研究,构建了二萜合成酶(TPS)基因研究平台,高通量筛选有效成分TPS基因,分析其结构特点与功能,阐释其表达特征;并以上述平台为基础,研究多效唑提高毛喉鞘蕊花有效成分及指标成分isofoskolin的分子机制。本论文研究可为通过植物生理学方法提高毛喉鞘蕊花有效成分提供方法,并为种植毛喉鞘蕊花主要有效成分的代谢和富集提供科学依据,以期通过遗传改良手段培育优良种质资源提供基础,进而从源头提高种植药材的品质。主要研究结果如下:1.毛喉鞘蕊花全长均一化cDNA文库的构建以毛喉鞘蕊花根、根茎、茎、叶、花为材料,采用SMART法与DSN均一化相结合构建了全长均一化cDNA文库,库容数约为1600,转化菌液体积1.5ml,计算得出菌液滴度是为1.6×106cfu/ml。以整个连接10μl计算库容大于5.2×106。从文库中随机挑取30个克隆进行菌落pcr鉴定,结果显示cdna插入片段介于1-3kb。因此,本研究构建的毛喉鞘蕊花全长均一化cdna文库质量较高。2.est测序及生物信息学分析从cdna文库中随机挑选了4224个单克隆进行sanger测序,经过组装得到2394条unigene,unigene平均长度753bp。对unigene进行nr、go及kegg功能注释。2263条unigene被nr数据库注释,在这些基因中存在有大量的涉及生长发育、物质和能量代谢等方面的基因。go功能分类显示,2100条(占87.7%)注释到了一个或多个go类别,所得go类别的总数为12121,分属于3个go主类别。kegg代谢途径分析表明,1716条(占71.7%)unigene被分配到6个主代谢途径中,其中17个unigenes被确定可能参与类萜生物合成的骨干和单萜、二萜、三萜2个二萜合成酶(柯巴烯焦磷酸合酶、贝壳杉烯氧化酶)、3个单萜合成酶(月桂烯/罗勒烯合酶、新薄荷醇脱氢酶、柠檬烯合酶)和1个三萜合成酶(β-香树脂醇合成酶)。3.毛喉鞘蕊花cfcps基因的克隆、序列分析及表达研究在est测序的基础上,从unigene中挑选柯巴烯焦磷酸合酶(cps)基因序列的片段,利用race技术得到全长cdna序列,结果表明cfcps基因全长2418bp。构建表达载体,利用大肠杆菌表达体系,获得了cfcps蛋白。对毛喉鞘蕊花cfcps进行生物信息学分析发现,该序列的全长为2418bp,编码805个氨基酸,分子量为92235,分子式为c4166h6415n1101o1219s29,pi为5.70。与迷迭香(rosmarinusofficinalis)、丹参(salviamiltiorr)、欧夏至草(marrubiumvulgare)、板栗(castananeamollissima)、桃(prunuspersica)、甘草(scopariadulcis)、番茄(solanumlycopersucum)、玉米(zeamays)植物的tps蛋白进行多重比对,发现它们具有较高的同源性性。通过构建系统进化树,发现cfcps蛋白与迷迭香、丹参tps蛋白的亲缘关系比较近。进一步研究发现,cfcps蛋白有跨膜区域和信号肽,属于可溶性蛋白。利用q PCR检测毛喉鞘蕊花Cf CPS基因在植物体的表达发现,毛喉鞘蕊花CfCPS基因在根表达量较高。4.多效唑提高毛喉鞘蕊花有效成分的分子机制在上述鞘蕊苏cDNA文库研究获得的萜类生物合成关键基因的基础上,我们又开展了多效唑处理提高毛喉鞘蕊花二萜类成分生物合成的研究。结果表明,多效唑(100mg/L)处理毛喉鞘蕊花植株,可显著改善植株株型,并显著提高毛喉鞘蕊花根、根茎和茎中isoforskolin含量,提高幅度高达53%。qPCR检测多效唑处理后叶片及根中萜类生物合成关键基因的表达水平发现,叶中ACCT、HMGR、DXR、IDI、GGPS和KAO等6个基因的表达被显著诱导,根中除CPS基因的表达量先升后降外,其余几个基因的表达量均呈下降趋势。因此,我们推测多效唑提高毛喉鞘蕊花有效成分的分子机制主要是诱导ACCT、HMGR、DXR、IDI、GGPS、KAO和CPS等基因的表达。
【关键词】:毛喉鞘蕊花 生物合成 功能基因 萜类骨架 多效唑
【学位授予单位】:湖北中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S567;Q943.2
【目录】:
  • 摘要6-9
  • Abstract9-13
  • 略缩词表13-14
  • 前言14-15
  • 第一章 文献综述15-33
  • 1 cDNA文库研究现状及分析15-19
  • 1.1 cDNA文库的构建原理和方法15-18
  • 1.2 cDNA文库在药用植物上的应用简介18-19
  • 2 EST测序研究进展19-24
  • 2.1 EST测序的原理19-22
  • 2.2 EST测序的应用22-24
  • 3 毛喉鞘蕊花二萜类成分生物合成机制研究进展24-33
  • 3.1 毛喉鞘蕊花二萜类成分简介24-26
  • 3.2 毛喉鞘蕊花的二萜类成分生物合成机制研究26-33
  • 第二章 毛喉鞘蕊花cDNA文库的构建33-44
  • 1 材料与方法33-39
  • 1.1 材料33-34
  • 1.2 方法34-39
  • 2 结果与分析39-42
  • 2.1 总RNA提取与检测39
  • 2.2 双链cDNA文库的合成及检测39-40
  • 2.3 均一化结果40-41
  • 2.4 毛喉鞘蕊花cDNA文库质量鉴定41-42
  • 3 讨论42-44
  • 第三章 EST测序及生物信息学分析44-60
  • 1.材料与方法44-48
  • 1.1 测序样品44-45
  • 1.2 测序引物45
  • 1.3 测序仪器45
  • 1.4 测序流程45-46
  • 1.5 生物信息学分析46-48
  • 1.6 毛喉鞘蕊花TPS基因筛选48
  • 2.结果与分析48-57
  • 2.1 EST测序48-49
  • 2.2 ORF结果49-52
  • 2.3 unigene的GO功能注释52-53
  • 2.4 unigene的代谢途径分析53-55
  • 2.5 毛喉鞘蕊花TPS基因筛选55-57
  • 3 讨论57-60
  • 第四章 CfCPS基因克隆、序列分析及表达研究60-95
  • 1 材料与方法60-74
  • 1.1 实验材料60-61
  • 1.2 实验方法61-74
  • 2 结果与分析74-93
  • 2.1 3’-RACE扩增74-75
  • 2.2 5’-RACE75-76
  • 2.3 毛喉鞘蕊花CPS基因全长的拼接76-78
  • 2.4 序列的生物信息学分析78-90
  • 2.5 qPCR90-91
  • 2.6 Cf CPS基因的功能验证91-93
  • 3 讨论93-95
  • 第五章 多效唑对毛喉鞘蕊花有效成分合成的促进作用及其分子机制研究95-105
  • 1 材料与方法95-99
  • 1.1 植物材料95
  • 1.2 多效唑处理及样品采集95-96
  • 1.3 isoforskolin含量测定96-97
  • 1.4 qPCR检测基因表达量97
  • 1.5 数据统计分析97-99
  • 2 结果与分析99-103
  • 2.1 多效唑处理对植株形态及生物量的影响99-100
  • 2.2 多效唑处理对isoforskolin积累的影响100-102
  • 2.3 多效唑处理对二萜类生物合成基因表达的影响102-103
  • 3 讨论103-105
  • 结语与创新105-107
  • 参考文献107-119
  • 附录119-121
  • 一、攻读博士学位期间发表的学术论文119-120
  • 二、实验中使用到的生物信息学相关软件、数据库链接和版本号.107致谢120-121
  • 致谢121

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