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《暨南大学》 2016年
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S-poly(T)PCR筛选结直肠癌血浆miRNA作为诊断标记物的研究

谭彦  
【摘要】:目的:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是目前常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率较高,早期诊断及治疗是降低结直肠癌病死率、改善预后的重要途径。目前,临床缺乏创伤小、花费低、高灵敏度和特异度的结直肠癌诊断手段,寻找一种有效、可靠的早期诊断方式至关重要。目前,越来越多的研究表明非编码小RNA(microRNA,miRNA)在结直肠癌患者血浆中异常表达,有望成为早期诊断的新标志物。本研究将探讨利用S-poly(T)PCR筛选结直肠癌相关miRNA,了解其成为结直肠癌诊断标志物的可行性及临床价值,并对筛选出的miRNA进一步行生物信息学分析,寻求miRNA可作为结直肠癌诊断标志物的理论依据。方法:本院病理确诊的101例结直肠癌患者、20例结直肠非癌性息肉,134例健康人血浆样本第一步(初筛阶段)将结直肠癌53例以及健康人87例分别混合为一份,利用S-poly(T)PCR技术,对已知血液中表达的485miRNA进行检测筛选出存在显著性异常表达的miRNA。第二步(复筛阶段)将此前53例结直肠癌样本按照TNM分期,将结直肠癌I-II期33例、结直肠癌III-IV期20例及健康人87例样本分别混合成一份,利用S-poly(T)PCR技术,对第一步中筛选出差异表达的miRNA进行检测,选出备选miRNA用于单个验证。第三步(验证阶段)对48例结直肠癌、20例结直肠非癌性息肉、47例健康人血浆样本进行单个验证,分析各miRNA表达水平与病理分期、肿瘤大小、肿瘤位置等的相关性,评估miRNA对结直肠癌的临床诊断能力。通过生物信息学预测在第一部分筛选出的结直肠癌相关miRNA的靶基因,并对靶基因功能富集分析、信号转导通路富集分析,为筛选出的miRNA用于结直肠癌诊断提供部分理论依据。结果:初筛阶段对本院收集的53例结直肠癌、87例健康人分别做血浆混合样本,利用S-poly(T)PCR技术检测485个miRNA,按照以下标准:FC(fold change)1或FC-1、p0.05,单个样本Ct值35。筛选出显著差异的16种miRNA,其中2种miRNA上调,14种miRNA下调。复筛阶段利用S-poly(T)PCR技术检测16种miRNA,按照三组间均差异表达的标准,最终选定9种miRNA用于单个验证,其中8种miRNA下调表达,1种miRNA上调表达。对48例结直肠癌、20例非癌性息肉、47例正常对照组血浆样本进行单个验证,结果显示:其中7种miRNA可显著区分结直肠癌与正常人:miR-27a-3p(t=6.11,p0.00)、miR-144-3p(t=7.34,p0.00)、miR-148a-3p(t=5.01,p0.00)、miR-423-3p(t=6.48,p0.00)、miR-424-5p(t=6.68,p0.00)、miR-425-5p(t=7.74,p0.00)、miR-1260b (t=4.87,p0.00),此7种miRNA均为下调表达。其灵敏度和特异度可分别达到:75.0%和85.0%、72.9%和78.7%、93.8%和78.7%、79.2%和91.5%、79.2%和93.6%、83.3%和91.5%、81.3%和83.3%。经过一致性检验,提示上述miRNA和金标准石蜡病理诊断有较好的一致性。利用logistic回归进行分析,获得最佳诊断组合:miR-144-3p、miR-425-5p、miR-1260b,其组合的灵敏度和特异性可分别达到93.8%和91.3%。在分析miRNA表达水平与分期、肿瘤大小、肿瘤位置相关性时,并未发现可用于区分分期、肿瘤大小、肿瘤位置的miRNA。通过生物信息学方法对第一部分筛选出的3种miRNA诊断组合(miR-144-3p、miR-425-5p、miR-1260b)进行靶基因预测、KEGG及Reactome信号通路分析,利用KEGG生物通路数据库对3种miRNA差异表达的靶基因进行生物通路富集分析,发现miR-144-3p显著富集于轴突传导通路,miR-425-5p主要富集于Ca离子信号通路。利用Reactome生物学反应及信号通路数据库对3种miRNA差异表达的靶基因进行生物通路富集分析,发现miR-144-3p主要富集到PI3K、PDGF等经典传导通路,miR-425-5p主要富集到鸟苷酸环化酶、c GMP等相关通路。结论:本研究利用S-poly(T)PCR筛选结直肠癌miRNA诊断标记物,经过三步法筛选出miR-27a-3p、miR-143-3p、miR-144-3p、miR-148a-3p、miR-424-5p、miR-425-5p、miR-1260b等7个miRNA对结直肠癌诊断具有临床标记物价值,与病理石蜡诊断有较好的一致性;miR-144-3p、miR-425-5p、miR-1260b三种miRNA联合诊断结直肠癌的灵敏度和特异性均超过90%,远超过目前临床常用的CEA等肿瘤标志物,具有潜在临床应用价值。生物信息学结果显示miR-144-3p显著富集于轴突传导、PI3K、PDGF等传导通路,miR-425-5p主要富集于Ca离子信号通路、鸟苷酸环化酶及c GMP等相关通路,由于现在鲜有报道提示miR-1260b与结直肠癌相关,进行信号通路富集分析是并未发现miR-1260b有任何富集。但仍证明miRNA可通过调控多个靶基因参与信号通路的调节,在结直肠癌的发生、发展中起重要作用,也为血浆中异常表达的miRNA用于结直肠癌诊断提供理论依据。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R735.34

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