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《广州中医药大学》 2014年
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参环毛蚓肠上皮细胞生物学特征的研究

卢瑞珊  
【摘要】:目的:系统研究参环毛蝴肠上皮细胞(IEC)的一般生物学特征和特殊生物学特征,建立IEC生物学相关的检测方法及参考标准;获得与IEC细胞形态、结构、代谢、增殖等方面有价值的实验数据,为今后与分子生物学技术进一步结合、深入研究细胞内的DNA的复制和转录、蛋白质的合成、能量代谢和细胞增殖动力学等内容夯实基础,也为其它以细胞为材料的相关研究提供必要的技术支持。方法:1.通过光学显微镜对传代至2~3代处于对数生长期的IEC进行细胞形态观察,采用Viewfinder图像采集软件捕获细胞图像。采用透射电镜来观察IEC细胞绒毛、细胞器、细胞核等超微结构,参考已报道的蚯蚓细胞超微结构,对IEC细胞器进行准确分类。2.借鉴哺乳类动物染色体核型分析的实验方法,对IEC进行染色体核型分析。在倒置显微镜下寻找染色体没有重叠,数目完整且分散开的、形态清晰的细胞,捕捉图像。利用Adobe Photoshop 8.0图像软件,以标准样式处理染色体形态数据,利用Excel制作核型模式示意图。根据Levan(1964年)提出的按着丝点的位置对染色体进行命名和分类。3.以其他类似动物的细胞周期检测方法作为参考依据,分别考察IEC的破膜剂条件和染色液组成成分。以细胞膜破碎程度、细胞周期直方图图形分布情况、变异系数(CV值)、细胞碎片含量(%Debris)、细胞总数(Cell No.)4种参数来共同评价4种染色方案的优劣,确定组成出检测IEC细胞周期的最佳实验条件,建立检测IEC细胞周期的最优方案。4.对2~3代处于指数生长期的IEC给予不同浓度梯度的Cd2+进行胁迫处理,在37℃、体积分数5%CO2环境下孵育0、12、24和48h。利用参环毛蚓IEC形态学以及细胞存活率和活力2个生理学指标评价IEC对重金属Cd2+的耐受能力,实验图像和数据分别采用Microsoft Excel和SPSS17.0软件进行处理分析。结果:1.研究发现IEC细胞直径约为8±2 μ m,细胞形态从圆柱形变成圆形或椭圆形,绒毛也因环境的改变出现了功能性衰退现象。而线粒体、蛋白颗粒、内质网和粗面内质网在空间呈现特异性分布。2.参环毛蚓IEC染色体核型结果表明,参环毛蚓具有22条染色体,共11组染色体,为二倍体生物。染色体核型表示为n(♂ =x=6m+3sm+2st。IEC在体外培养时,形态虽然出现应激性改变,但是其染色体组形态和数目并没有出现明显的变异,在表观上可认为IEC基因组相对稳定。3.综合细胞膜破碎情况,以及细胞厨期直方图图形分布情况、CV值、细胞碎片含量(%Debris)、细胞总数(Cell No.)4种参数来共同评价IEC细胞周期的最佳检测条件,获得了一套最佳染色方案:0.1%TritionX-100+10μg/mLPI+50μg/mLRNase。从细胞周期直方图中可知,处于G1期的细胞占了总细胞数量的93%以上,客观的证实了体外培养的IEC具有漫长的物质准备期。此外,细胞厨期中DNA含量检测结果与证实了参环毛蚓为二倍体生物(diploid),该结果与染色体核型分析结果一致。4.IEC对Cd2+的耐受特性主要表现为以下几方面:①未经孵育时IEC可耐受的最高浓度Cd2+为8 μ mol/mL;②胁迫处理24h后IEC可耐受的最高浓度Cd2+为6.25X 10-2μ mol/mL;③胁迫处理48h时,IEC可耐受的最高浓度Cd2+为3.125X l0-2μ mol/mL。上述三个浓度分别是《中华人民共和国药典》(2010年版)中地龙项下镉限量指标的2997.33、23.33和11.66倍。④IEC对Cd2+的耐受性在一定的时间范围内与剂量呈负相关。结论:本项研究从最基础性的观察IEC细胞形态学特征到超微水平上细胞内部组成结构的辨认,获得了一整套与IEC相关的形态学信息和一般生物学特征。与此同时,本文经筛选优化,建立了适合于IEC染色体核型分析和细胞周期的检测条件和方法,掌握了详细的关于IEC细胞生长及繁殖的活动规律。此外,本文还采集到IEC细胞对重金属Cd2+具有高耐受能力这一特殊习性的重要证据,并清晰地了解到IEC对重金属Cd2+的最大耐受浓度及对Cd2+应激反应和耐受的规律,为在细胞和分子水平上阐明其重金属富集机制提供有价值的实验依据。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:Q952;R282.74

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