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《四川农业大学》 2014年
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鸭瘟病毒US2蛋白特性分析及小RNA干扰对US2基因功能影响初探

高洁  
【摘要】:关于鸭瘟病毒(Duck Plague Virus, DPV)US2基因的研究很少,本论文将本实验注册的DPV-CHv株US2基因(GenBank Accession:EU195086)进行了生物信息、学分析,开展原核表达、US2蛋白纯化、兔抗蛋白抗体的制备等,然后分别通过实时荧光定量PCR和Western Blot来检测US2基因在DPV感染鸭胚成纤维细胞过程中转录水平的变化以及表达动力学过程。为了更清晰地揭示US2蛋白在细胞中的动态过程,我们采用了间接荧光免疫方法来检测US2的定位,同时通过病毒蛋白酶K实验鉴定了US2蛋白属性。为了验证US2基因是否有抗原递呈功能,用小RNA干扰载体来干扰US2基因的功能,然后用MHC ELISA试剂盒来检测US2基因干扰前后的MHC水平的变化。1.鸭瘟病毒US2基因的克隆、原核表达以及多抗的制备对鸭瘟病毒US2基因进行序列分析、克隆及原核表达,并利用获得的His重组蛋白分别制备了兔抗US2-IgG多克隆抗体,抗体琼扩效价为1:16。2.鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后US2基因mRNA转录水平、表达动力学及细胞定位分析采用实时荧光定量PCR技术对DPV感染DEF不同时期US2 mRNA的水平变化进行荧光定量分析;并提取不同感染时期细胞蛋白,利用蛋白免疫印迹法检测US2蛋白在DEF中的表达水平变化。荧光定量结果表明:DPV感染DEF 24h至72h,US2基因转录水平持续上升,84h至96h US2 mRNA含量急剧下降,与对照组的转录水平相比,有明显差异。免疫印迹结果表明,DEF感染DPV从48h开始能明显检测到US2蛋白。间接荧光免疫实验显示DEF感染DPV从39h-50h,蛋白主要集中在细胞膜上,而且越来越多;从60h开始集中在细胞质和细胞核周围,到了84h时,蛋白在细胞质中明显增多。3.利用小RNA干扰US2基因的表达,检测到被DPV感染的DEF细胞表面MHC的表达量有所减少针对US2 ORF的不同靶区,我们设计并合成4个shRNA载体以确保靶基因被有效抑制。目的是筛选出有效的干扰shRNA来干扰DPV US2基因转录,为研究DPV US2基因的功能提供基础。用荧光定量技术筛选出能有效干扰US2基因转录的RNA载体,然后干扰US2转录表达,用MHC ELISA试剂盒检测到DEF细胞表面上的MHC的表达量有显著增加,该实验可以推断DPV US2基因对DEF细胞表面的MHC抗原递呈分子的表达有抑制作用。4.用浓缩纯化的病毒颗粒进行病毒蛋白酶K实验证实了US2蛋白是皮层蛋白研究鸭瘟病毒US2基因表达产物是否属于结构蛋白,属于哪种结构蛋白,对探索其基因编码蛋白的功能、病毒的转染、出芽、释放等具有重要的意义。目前文献中提到US2蛋白在疱疹病毒中属于外膜或者皮层蛋白,但是对DPV的US2蛋白是哪种蛋白并没有作探究。该实验利用高浓度蔗糖溶液来浓缩病毒粒子,然后分别用去垢剂SDS和蛋白酶K分别来溶解DPV的外膜脂溶性蛋白和其他蛋白成分,同时用已经明确是皮层蛋白的UL51蛋白作为对照,实验结果证明了US2蛋白在DPV中是一种皮层蛋白。
【关键词】:鸭瘟病毒 US2基因 克隆表达 转录表达 小RNA干扰 皮层蛋白
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 中文摘要3-5
  • ABSTRACT5-10
  • 一、引言10-16
  • 1 鸭瘟概述10
  • 1.1 鸭瘟10
  • 1.2 病原10
  • 1.3 流行病学10
  • 1.4 防控措施10
  • 2 疱疹病毒US2基因及其编码蛋白的研究进展10-14
  • 2.1 疱疹病毒基因组的特点11
  • 2.2 US2基因的特点11
  • 2.3 US2基因编码蛋白US2的特点11-12
  • 2.4 疱疹病毒US2蛋白的功能12-14
  • 2.4.1 US2蛋白与病毒毒力12
  • 2.4.2 US2蛋白在细胞代谢方面的作用12-13
  • 2.4.3 US2蛋白在细胞免疫应答方面的作用13-14
  • 3 US2编码蛋白与其他蛋白的相互作用14-15
  • 3.1 US2编码蛋白与Us10蛋白的相互作用14-15
  • 3.2 US2编码蛋白和Us11蛋白的作用15
  • 4 展望15
  • 5 选题目的和意义15-16
  • 二、试验研究16-38
  • 1 材料16
  • 1.1 动物及毒株、菌种、载体16
  • 1.2 主要试剂16
  • 1.3 主要仪器设备16
  • 2 方法16-23
  • 2.1 DPV US2生物信息学分析17-18
  • 2.1.1 核苷酸序列分析17
  • 2.1.2 US2基因编码氨基酸翻译和蛋白质组分分析17
  • 2.1.3 氨基酸序列比对17
  • 2.1.4 系统进化树分析17
  • 2.1.5 氨基酸功能预测17-18
  • 2.2 DPV US2基因原核表达及多克隆抗体制备18-20
  • 2.2.1 引物设计和合成18
  • 2.2.2 DPV基因组DNA提取18
  • 2.2.3 DPV US2基因的PCR扩增18
  • 2.2.4 DPV US2基因的PCR扩增产物回收18
  • 2.2.5 US2基因的克隆18-19
  • 2.2.6 表达、纯化DPV US2蛋白19
  • 2.2.7 制备兔抗DPV US2多克隆抗体19-20
  • 2.3 DPV US2基因转录水平和基因类型分析20-21
  • 2.3.1 引物设计20
  • 2.3.2 鸭瘟病毒US2基因类型分析20-21
  • 2.3.3 鸭瘟病毒US2基因转录水平变化研究21
  • 2.4 DPV US2基因表达动力学、蛋白属性和细胞定位研究21-22
  • 2.4.1 DPV US2蛋白表达动力学21-22
  • 2.4.2 DPV US2蛋白细胞定位22
  • 2.4.3 DPV US2蛋白结构分析22
  • 2.5 小RNA干扰对DPV US2基因功能影响探究22-23
  • 2.5.1 靶向DPV US2基因的RNAi重组真核质粒的构建23
  • 2.5.2 荧光定量PCR筛选对US2转录的抑制效率最高的shRNA载体23
  • 2.5.3 靶向shRNA对US2在感染不同时间点的抑制效率23
  • 2.5.4 ELISA试剂盒检测MHC复合物23
  • 3 结果23-34
  • 3.1 DPV US2生物信息学分析23-26
  • 3.1.1 DPV US2核苷酸序列分析23-26
  • 3.2 DPV US2基因原核表达及多克隆抗体制备26-28
  • 3.2.1 DPV US2基因的PCR扩增、克隆的构建26-27
  • 3.2.2 重组蛋白DPV US2的表达和纯化27
  • 3.2.3 重组蛋白DPV US2反应原性检测27-28
  • 3.2.4 重组蛋白DPV US2多克隆抗体效价检测28
  • 3.3 DPV US2基因转录水平和基因类型分析28-30
  • 3.3.1 药物抑制试验结果28
  • 3.3.2 标准曲线制作和转录时相结果分析28-30
  • 3.4 DPV US2基因表达动力学、蛋白属性和细胞定位研究30-32
  • 3.4.1 DPV US2蛋白结构分析30-31
  • 3.4.2 DPV US2蛋白表达动力学31
  • 3.4.3 DPV US2蛋白在感染细胞内定位分析31-32
  • 3.5 小RNA干扰对DPV US2基因功能影响探究32-34
  • 3.5.1 筛选干扰效率最高的shRNA载体32
  • 3.5.2 筛选出靶向shRNA对DPV US2的最佳干扰时间32-33
  • 3.5.3 鸭胚成纤维细胞表面MHC复合物ELISA检测33-34
  • 4 讨论34-38
  • 4.1 DPV US2生物信息学分析34-35
  • 4.2 DPV US2基因原核表达及多克隆抗体制备35
  • 4.3 DPV US2基因转录水平和基因类型分析35-36
  • 4.4 DPV US2基因表达动力学、蛋白属性和细胞定位研究36
  • 4.5 小RNA干扰对DPV US2基因功能影响探究36-38
  • 三、结论38-39
  • 四、参考文献39-44
  • 致谢44-45
  • 作者简介及攻读硕士学位期间发表的学术论文45

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