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《四川农业大学》 2014年
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鸭瘟病毒US2蛋白特性分析及小RNA干扰对US2基因功能影响初探

高洁  
【摘要】:关于鸭瘟病毒(Duck Plague Virus, DPV)US2基因的研究很少,本论文将本实验注册的DPV-CHv株US2基因(GenBank Accession:EU195086)进行了生物信息、学分析,开展原核表达、US2蛋白纯化、兔抗蛋白抗体的制备等,然后分别通过实时荧光定量PCR和Western Blot来检测US2基因在DPV感染鸭胚成纤维细胞过程中转录水平的变化以及表达动力学过程。为了更清晰地揭示US2蛋白在细胞中的动态过程,我们采用了间接荧光免疫方法来检测US2的定位,同时通过病毒蛋白酶K实验鉴定了US2蛋白属性。为了验证US2基因是否有抗原递呈功能,用小RNA干扰载体来干扰US2基因的功能,然后用MHC ELISA试剂盒来检测US2基因干扰前后的MHC水平的变化。1.鸭瘟病毒US2基因的克隆、原核表达以及多抗的制备对鸭瘟病毒US2基因进行序列分析、克隆及原核表达,并利用获得的His重组蛋白分别制备了兔抗US2-IgG多克隆抗体,抗体琼扩效价为1:16。2.鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后US2基因mRNA转录水平、表达动力学及细胞定位分析采用实时荧光定量PCR技术对DPV感染DEF不同时期US2 mRNA的水平变化进行荧光定量分析;并提取不同感染时期细胞蛋白,利用蛋白免疫印迹法检测US2蛋白在DEF中的表达水平变化。荧光定量结果表明:DPV感染DEF 24h至72h,US2基因转录水平持续上升,84h至96h US2 mRNA含量急剧下降,与对照组的转录水平相比,有明显差异。免疫印迹结果表明,DEF感染DPV从48h开始能明显检测到US2蛋白。间接荧光免疫实验显示DEF感染DPV从39h-50h,蛋白主要集中在细胞膜上,而且越来越多;从60h开始集中在细胞质和细胞核周围,到了84h时,蛋白在细胞质中明显增多。3.利用小RNA干扰US2基因的表达,检测到被DPV感染的DEF细胞表面MHC的表达量有所减少针对US2 ORF的不同靶区,我们设计并合成4个shRNA载体以确保靶基因被有效抑制。目的是筛选出有效的干扰shRNA来干扰DPV US2基因转录,为研究DPV US2基因的功能提供基础。用荧光定量技术筛选出能有效干扰US2基因转录的RNA载体,然后干扰US2转录表达,用MHC ELISA试剂盒检测到DEF细胞表面上的MHC的表达量有显著增加,该实验可以推断DPV US2基因对DEF细胞表面的MHC抗原递呈分子的表达有抑制作用。4.用浓缩纯化的病毒颗粒进行病毒蛋白酶K实验证实了US2蛋白是皮层蛋白研究鸭瘟病毒US2基因表达产物是否属于结构蛋白,属于哪种结构蛋白,对探索其基因编码蛋白的功能、病毒的转染、出芽、释放等具有重要的意义。目前文献中提到US2蛋白在疱疹病毒中属于外膜或者皮层蛋白,但是对DPV的US2蛋白是哪种蛋白并没有作探究。该实验利用高浓度蔗糖溶液来浓缩病毒粒子,然后分别用去垢剂SDS和蛋白酶K分别来溶解DPV的外膜脂溶性蛋白和其他蛋白成分,同时用已经明确是皮层蛋白的UL51蛋白作为对照,实验结果证明了US2蛋白在DPV中是一种皮层蛋白。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S852.65

【参考文献】
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