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《成都中医药大学》 2016年
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川牛膝道地性形成的表观遗传机制的初步研究

文静  
【摘要】:中药材道地性的形成与药用植物的生长环境、表型可塑性和遗传背景密切相关。植物的表型变异是基因与环境共同作用的结果。表观遗传是连接基因与环境的桥梁,DNA甲基化是最重要的表观遗传现象,在探讨道地性的形成及演化过程中具有重要意义。川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)为苋科药用植物,系著名川产道地药材。利用甲基化敏感扩增多态性技术(Methylation Sensitive Amplified Polymorphism, MSAP)研究川牛膝种群在生物和非生物因子作用下的基因型和DNA甲基化式样的统计学特征,以及具有多态性的甲基化位点所涉及的基因,对于探索川牛膝道地性的形成机制,控制川牛膝在道地产区的稳定性和预测可引种栽培的范围都具有重要意义。本文研究内容及成果如下:(1)建立和优化了川牛膝MSAP反应体系,具体为:CTAB法为DNA最佳提取方法;反应总体积为25μL,模板量为200 ng,酶切时间为2h时双酶切效果最佳;25μL预扩增体系中,连接产物1μL、rTaq酶1 U、引物1.5μL、dNTP2μL时最佳;选择性扩增体系中,预扩增产物稀释50倍、rTaq酶1 U、引物1.5μL、dNTP3μL时扩增产物特异性较好,并筛选出6套适宜的引物(E1HM1、 E2HM2、E3HM5、E4HM6、E5HM3、E6HM4),解决了川牛膝MSAP技术中的酶切、预扩增和选择性选扩增中存在的难题,为后续实验的顺利进行提供了技术支持。(2)对白锈病胁迫下不同产地川牛膝表现出的抗病差异性进行研究,发现在抵御白锈病的过程中,来自小沟村的样品抗病能力明显较强,并从甲基化样式、甲基化水平、和遗传多样性方面进行分析。结果表明抗病性最强的小沟村川牛膝存在4种甲基化样式,整体甲基化水平偏高(47.5-52.3%),遗传多样性(H=0.2054,I=0.2930)和表观遗传多样性(H=0.1859,I=0.2660)丰富,并且比较了遗传与表观遗传多样性对抗病差异性的贡献,发现遗传多样性对不同产地川牛膝抗病性差异影响大于表观遗传多样性。(3)对栽培在相同环境中不同产地的川牛膝进行了遗传背景与表观遗传变异研究,并对原产地的生态因子进行分析。结果表明生态因子变异在重庆产区最大,依次为四川产区、两湖(湖南、湖北)产区,变异系数分别为1.95、1.61、0.87。按遗传背景聚类分析,重湖(重庆、湖南、湖北)居群表观遗传多样性较高(H=0.1949,I=0.2799),而乐山居群较低(H=0.1541,I=0.2249),两居群间表观遗传距离较大(D’=0.1280),表型差异一致度较小(J'=0.8798)。比较按气候类型和遗传背景两种分类,发现两湖产区与重庆产区样品遗传背景相似,但分属于两种气候类型;而气候类型比较一致的乐山居群与雅安居群其遗传背景差异较大,推测两湖产区样品间的表观遗传差异受气候类型影响较大,而雅安产区和乐山产区样品间的差异受遗传背景影响较大。(4)对不同海拔川牛膝的遗传背景和表观遗传变异程度进行分析。遗传背景分析表明,不同海拔样品遗传一致度J均大于0.9500,遗传背景相似性高;表观遗传变异分析表明,毛岗子和小沟村川牛膝遗传距离(D=0.0117)和表观遗传距离(D'=0.0407)均较小,两个地区样品表型关系最近,因此,毛岗子可作为川牛膝引种的备选地。综合分析表明,海拔因素对川牛膝遗传背景影响较小,但对表观遗传变异影响较大。(5)对道地产区不同生长年限川牛膝的遗传背景和表观遗传稳定性进行分析。遗传背景分析表明,不同生长年限样品间遗传一致度(J)均大于0.9400,样品遗传背景相似性高;表观遗传变异分析表明,一年生与三年生样品表观遗传距离(D'=0.1846)较大,表观遗传一致度(J'=0.8315)较小;从表观遗传稳定性分析,一、二、三年生川牛膝变异系数分别为28.3、9.9、49.5,表明两年生川牛膝表观遗传稳定性较高。综合分析表明,生长年限对遗传背景的影响较小,但对表观遗传变异影响较大。以上研究初步探讨了不同环境条件对川牛膝道地性形成的贡献,为川牛膝的栽培和适宜产地选择提供了依据,对于环境-表型-遗传间相关性的研究具有重要意义,同时更有助于揭示中药道地性形成的分子机制。
【学位授予单位】:成都中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S567.239

【参考文献】
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