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《贵州医科大学》 2018年
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天冬等级划分的合理性及其遗传多样性研究

曹旭林  
【摘要】:目的:通过考察不同等级天冬药材的性状特征、质量化学评价指标和药效学指标研究天冬等级质量,并分析其相关性,探讨传统标准划分天冬等级的合理性,为天冬行业等级标准的规范化提供实验依据。建立天冬的RAPD分子标记技术并分析其遗传多样性,为天冬种质资源的选育提供理论依据。方法:(1)天冬性状研究按照《76种药材商品规格标准》,划分天冬药材等级,并对药材中部直径和药材长度性状特征进行量化。(2)天冬化学评价指标的测定根据2015年版《中国药典》,对不同等级天冬药材水分、总灰分、二氧化硫残留量及醇溶性浸出物进行测定;采用紫外可见分光光度法测定不同等级天冬药材中多糖与皂苷含量;运用SPSS17.0统计软件分析天冬药材等级与化学评价指标的相关性;运用主成分分析综合评价不同等级天冬药材质量,并建立多项Logistic回归模型,以该模型对天冬药材等级进行初步判别。(3)不同等级天冬药效学指标的考察采用小鼠氨水引咳法和小鼠气管酚红排泌法分别考察不同等级天冬的止咳与祛痰作用;运用SPSS17.0统计软件分析天冬药材等级与止咳及祛痰作用的相关性。(4)天冬RAPD分析对RAPD反应体系中的DNA模板、引物及2×Taq PCR Master Mix浓度进行优化,建立天冬RAPD-PCR最优扩增体系;以最优反应体系对天冬进行RAPD扩增,采用NTSYS2.10e软件对不同居群天冬的遗传多样性进行分析。(5)质量标准研究根据2015年版《中国药典》天冬检查项下的规定,对天冬进行检查;以紫外分光光度法测定天冬中主要有效成分皂苷的含量,建立天冬的质量标准。结果:(1)天冬性状研究25批天冬药材划分为一等、二等、三等3个等级;不同等级天冬药材中部直径呈显著差异(P0.05);一等品与二等品比较,一等品与三等品比较药材长度均有显著差异,二等品与三等品比较药材长度差异无显著性(P0.05)。(2)天冬化学评价指标的测定天冬药材水分、总灰分、二氧化硫残留量及醇溶性浸出物含量分别为8.8%~17.2%,1.4%~4.8%,0~386.92μg·g~(-1),63.16%~94.43%。多糖含量在5.67%~29.38%;皂苷含量在0.19%~0.71%;不同等级天冬药材总灰分、醇溶性浸出物、多糖及皂苷含量呈显著差异(P0.05),水分含量与二氧化硫残留量差异较小。(3)天冬等级与化学评价指标相关性分析及其质量综合评价天冬药材等级与醇溶性浸出物及皂苷含量呈极显著的正相关关系(P0.01),与多糖含量呈显著正相关性(P0.05);主成分分析共提取出3个主成分,累积贡献率为76.173%,载荷较高的特征向量为皂苷、醇溶性浸出物、多糖、总灰分及二氧化硫残留量;在主成分分析基础上,建立了天冬等级预测模型,为LogisticP1=1.14x_1+1.98x_2-2.85x_3+4.65x_4+4.25x_5+4.89x_6-3.021;LogisticP2=-0.41x_1+1.03x_2-1.30x_3+1.50x_4+1.21x_5+1.37x_6+1.243,其判别正确率为83.8%。(4)不同等级天冬药效学指标的考察与生理盐水组比较,天冬水煎剂低、中、高剂量组能显著延长小鼠咳嗽潜伏期(P0.05),极显著减少小鼠3min内咳嗽次数(P0.01);中剂量组能极显著增加小鼠酚红排泌量(P0.01);一等品与三等品比较,小鼠3min内咳嗽次数和小鼠酚红排泌量有显著差异(P0.05),等级间差异均无显著性;天冬等级与小鼠3min内咳嗽次数呈极显著正相关关系(r=0.389,P0.01),与小鼠酚红排泌量呈显著负相关关系(r=-0.221,P0.05);小鼠3min内咳嗽次数与天冬醇溶性浸出物、皂苷含量呈显著负相关性(r0,P0.05),小鼠酚红排泌量与醇溶性浸出物和皂苷含量呈正相关关系。(5)天冬RAPD分析天冬RAPD-PCR最优扩增体系为2×Taq PCR Master Mix10.5μL,引物1.2μmol·25μL~(-1),48ng模板DNA,用ddH_2O补充至25μL;从60条随机引物中筛选出了20条有效引物,20条有效引物18份不同居群天冬样品共扩增出183条,具有多态性的条带有164条,其多态性比率为89.62%,遗传相似系数变化范围为0.4481~0.7486。(6)建立天冬质量标准天冬检查项基本符合药典规定,薯蓣皂苷元在0.0048~0.0240 mg·mL~(-1)线性关系良好(r=0.9998),平均加样回收率为97.34%,RSD值为2.5%(n=9),确定天冬药材中皂苷含量不得少于0.34%。结论:(1)天冬药材等级划分标准能反应天冬醇溶性浸出物、皂苷含量的高低及其止咳,祛痰作用的强弱,传统等级划分方法仍具有合理性;除药典规定的醇溶性浸出物含量外,天冬药材建议以测定皂苷含量为主,多糖含量为辅助质量评价指标。(2)不同居群天冬具有较高的遗传多样性,建立的RAPD分子标记可用于天冬的遗传多样性研究。(3)拟定的质量控制方法能有效评价天冬药材质量,为天冬药材含量测定方面的空白提供参考。
【学位授予单位】:贵州医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R282.71

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