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《西北农林科技大学》 2017年
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猪戊型肝炎病毒抗原性及诺如病毒与宿主蛋白互作的研究

王鑫杰  
【摘要】:本课题研究涉及戊型肝炎病毒和诺如病毒,两种病毒在病毒结构及其传染危害上有一定相似性。二者均为单股正链RNA二十面体病毒,都感染人及其它动物种属,病毒传播重要途径之一是粪口传播,前期都因无高效体外培养系统阻碍对病毒感染复制机理的研究。两种病毒在研究思路及方法上有很多可相互借鉴之处。第一部分猪戊型肝炎病毒戊型肝炎(Hepatitis E)由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起的一种传染性自限性肝炎。全球每年约有2000万人被HEV感染,导致约5.66万人死亡。哺乳动物HEV包括HEV-1到HEV-7七个亚型,其中HEV-3和HEV-4具有人畜共感染性,其可感染人、猪和兔等物种。猪是人畜共患HEV的主要储存库,在全球猪群内HEV抗体均呈现高阳性率(46%-100%)。实验证实猪HEV-3和HEV-4可以感染灵长类动物恒河猴,且在日本、法国、德国、西班牙和澳大利亚等人戊型肝炎散发案例表明:人HEV的感染与直接食用未煮熟的猪HEV污染的猪肉及脏器食品有关。基于猪HEV的人畜共患传播风险,本课题分离鉴定了山东地区猪HEV的流行毒株并对该地区猪群中HEV流行情况进行了调查。HEV衣壳蛋白包含病毒颗粒主要抗原表位,能够诱导体液免疫应答。对衣壳蛋白抗原结构精细化鉴定有利于促进血清诊断和疫苗的研发。研究证实,禽HEV衣壳蛋白中抗原区I(aa 389-410)中存在一个禽、人和猪HEV共有表位。但后续研究发现猪和人的抗HEV阳性血清能与不含抗原区I的禽HEV重组蛋白交叉反应,这表明还存在其它禽、人和猪HEV共有抗原表位。本课题精确鉴定了不同物种HEV共有抗原表位,加深了对HEV衣壳蛋白的抗原结构了解,并且对于开发HEV的血清诊断和疫苗设计有一定借鉴意义。1.山东地区猪戊型肝炎病毒基因组序列特征分析及感染率调查在本研究中,利用HEV ORF2部分基因建立的RT-n PCR方法检测了来自中国山东省屠宰场的106份胆汁样品中HEV RNA;利用间接ELISA方法对山东地区24个养殖场980猪血清样品中的抗猪HEV Ig M和Ig G特异性抗体阳性率进行了调查。研究发现106份胆汁样品中32份是HEV RNA阳性(30.2%),从样品中检测到20个不同同源性(86.8-100%)的ORF2片段序列。进化分析发现这些病毒序列属于基因4型HEV的4a和4d亚型。同时测定了一株4d亚型猪HEV毒株。对山东24个地区猪群中抗HEV抗体检测发现,不同地区Ig G和Ig M血清阳性率分别为100%(24/24)和41.7%(10/24),对猪个体阳性率分析,发现Ig G和Ig M的阳性率分别为69.4%(651/980)和1.6%(16/980)。结果表明,在山东地区猪养殖场和屠宰场中,基因4型HEV普遍流行,这对公共卫生安全是巨大挑战,应加强防护及安全保护措施。2.两个戊型肝炎病毒共有抗原表位的鉴定本研究发现,由禽HEV衣壳蛋白制备的单克隆抗体(MAb)3E8和1B5能与猪HEV衣壳蛋白发生交叉反应,暗示这两株抗体可能识别禽和猪HEV共有抗原表位。利用生物淘选、多肽合成、截短或突变的重组蛋白表达,综合利用ELISA和Western blot方法来鉴定和验证两株单克隆抗体所识别的抗原表位。结果发现,3E8表位核心区为I/VPHD,其中P和H是关键氨基酸;1B5表位为VKLYM/TS。两抗原表位在不同种属HEV衣壳蛋白序列中高度保守,推测它们可能也是野猪、兔、大鼠、雪貂、猫鼬、鹿和骆驼HEV的共有抗原表位。蛋白三维模型分析发现两个表位至少部分暴露于HEV病毒颗粒表面,推测其可能有中和活性,但中和保护性实验发现3E8和1B5表位对鸡没有保护作用。本研究鉴定了人、猪和禽HEVs衣壳蛋白上两个共有抗原表位,对了解HEV衣壳蛋白抗原结构和开发诊断试剂有推动作用。第二部分诺如病毒与宿主蛋白互作的研究诺如病毒(Hu No V)属单股正链RNA病毒,是引起人急性胃肠炎的主要病原。全球每年约20万人因Hu No V感染死亡,造成巨大经济损失。由于缺乏高效Hu No V体外培养系统,严重延缓了对病毒感染复制机理的研究。鼠诺如病毒(MNV)与Hu No V遗传关系密切,是研究诺如病毒感染复制机理的理想模型。VPg蛋白在病毒基因组复制、病毒蛋白翻译及抑制宿主细胞抗病毒反应等方面发挥重要作用,是构成具有感染性的RNA所必须的组分。VP2蛋白是由ORF3编码的次衣壳蛋白,参与病毒组装并能增强20面体病毒颗粒的稳定性,是形成具有感染性病毒的必要组分。但目前对宿主细胞中参与及辅助VPg及VP2蛋白功能及代谢过程的宿主蛋白尚不清楚,为此我们利用MNV模型,开展鉴定与诺如病毒VPg和VP2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白及其功能的研究。1.宿主细胞与诺如病毒VPg相互作用蛋白的鉴定本研究中,我们利用基于同位素标记(SILAC)的免疫共沉淀及质谱检测方法来鉴定宿主细胞中与MNV和Hu No V VPg相互作用蛋白。MNV VPg IP质谱实验检测到91个阳性宿主蛋白,其中37个蛋白会因F123A突变丧失与VPg互作能力。同样,Hu No V质谱数据显示95个宿主蛋白可能与WT VPg互作,同时F137A的突变导致12个蛋白不再结合。对MNV和Hu No V互作蛋白数据的共同分析发现,包括e IF3和e IF4F转录起始复合物(e IF3A、e IF4G1和e IF4E等)及G3BP1和YBX1在内的48个宿主蛋白与二者均有较强结合能力。其中,在鉴定的靶蛋白中包括已被证实与VPg相互作用的e IF4G1和e IF4E蛋白,证明SILAC GFP亲和纯化实验的可信性。基于前期研究背景,我们优先验证YBX1与G3BP1与VPg的相互作用,进而探究其在诺如病毒感染宿主细胞中参与的代谢过程及机理。2.鼠诺如病毒VP2蛋白与宿主细胞互作蛋白的鉴定为了探究MNV感染宿主细胞过程中与VP2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白及其作用机理,本研究利用带有FLAG标签的重组MNV以及基于SILAC标记的定量蛋白质组学技术,探究了MNV感染中参与VP2功能代谢的宿主蛋白。通过分析比较野生型病毒感染的阴性对照组与VP2-FLAG MNV感染的实验组IP样品质谱数据,共发现51种互作蛋白。其中,与VP2互作相关复合物,包含病毒非结构蛋白Ns1/2,Ns3,Ns4和VF1以及主要衣壳蛋白VP1。除此之外,在鉴定的宿主细胞蛋白中发现了已被证实为MNV受体的CD300lf蛋白以及在SV40病毒从内质网迁移到细胞质过程中的关键辅助蛋白BAP29,BAP31和Bip等。上述结果证明了本研究方案的有效性及结果的可信性,同时暗示其中的一些靶蛋白可能与VP2协同发挥作用参与了诺如病毒的感染过程。
【关键词】:戊型肝炎病毒 猪HEV 共有抗原表位 诺如病毒 鼠诺如病毒 蛋白-蛋白相互作用
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.651
【目录】:
  • 摘要6-9
  • Abstract9-18
  • 第一章 文献综述18-46
  • 1.1 戊型肝炎病毒研究进展18-36
  • 1.1.1 戊型肝炎病毒危害18
  • 1.1.2 HEV发现及分类18-21
  • 1.1.3 HEV进化史21-22
  • 1.1.4 HEV基因组结构22-25
  • 1.1.5 衣壳蛋白自组装25-27
  • 1.1.6 中和表位和疫苗27
  • 1.1.7 戊型肝炎流行情况27-30
  • 1.1.8 HEV的物种间传播30-32
  • 1.1.9 HEV传播途径32-34
  • 1.1.10 HEV实验室诊断34-36
  • 1.2 诺如病毒研究进展36-46
  • 1.2.1 诺如病毒发现及危害36-37
  • 1.2.2 诺如病毒基因组37-38
  • 1.2.3 诺如病毒感染及致病38-40
  • 1.2.4 病毒生命周期40-41
  • 1.2.5 病毒结构蛋白41-42
  • 1.2.6 VPg蛋白42-43
  • 1.2.7 诺如病毒、宿主与微生物之间的互作43-45
  • 1.2.8 鼠诺如病毒45-46
  • 第二章 山东地区猪戊型肝炎病毒基因组序列特征分析及感染率调查46-63
  • 2.1 研究背景与意义46
  • 2.2 实验材料46-47
  • 2.2.1 胆汁样品46
  • 2.2.2 血清样品46-47
  • 2.3 实验仪器与试剂47-48
  • 2.3.1 实验试剂47
  • 2.3.2 主要仪器47-48
  • 2.4 方法48-55
  • 2.4.1 RT-nPCR检测胆汁或血清样品中的猪HEV orf2基因48-49
  • 2.4.2 猪HEV毒株完整基因组序列的扩增49-51
  • 2.4.3 测序及进化分析51-52
  • 2.4.4 提交分离鉴定的HEV序列到Gen Bank52
  • 2.4.5 猪HEV ORF2重组蛋白的制备52-55
  • 2.4.6 i-ELISA55
  • 2.4.7 统计分析55
  • 2.5 实验结果55-61
  • 2.5.1 猪胆汁样品中猪HEV检测结果55-56
  • 2.5.2 猪HEV orf 2 基因序列比对结果56-57
  • 2.5.3 山东株猪HEV:CHN-SD-sHEV57-58
  • 2.5.4 重组蛋白表达纯化58-59
  • 2.5.5 确定i-ELISA cut-off值59
  • 2.5.6 山东地区猪HEV感染率研究59-61
  • 2.6 讨论61-62
  • 2.7 小结62-63
  • 第三章 两个戊型肝炎病毒共有抗原表位的鉴定63-81
  • 3.1 研究背景及意义63-64
  • 3.2 实验材料64-65
  • 3.2.1 血清样品64
  • 3.2.2 多肽64
  • 3.2.3 单克隆抗体64
  • 3.2.4 不同种属HEV毒株64-65
  • 3.3 实验仪器与试剂65
  • 3.3.1 实验试剂65
  • 3.3.2 主要仪器65
  • 3.4 实验方法65-68
  • 3.4.1 噬菌体展示技术筛选抗原表位65-66
  • 3.4.2 合成多肽66
  • 3.4.3 制备重组蛋白66-67
  • 3.4.4 间接ELISA67
  • 3.4.5 Western Blot67
  • 3.4.6 抗原表位与不同种属抗血清交叉反应67
  • 3.4.7 软件计算分析67-68
  • 3.4.8 免疫保护性分析68
  • 3.5 实验结果68-79
  • 3.5.1 两株禽单克隆抗体与猪HEV衣壳蛋白具有交叉反应性68-69
  • 3.5.2 抗原表位噬菌体生物淘选结果69-70
  • 3.5.3 抗原表位关键氨基酸的鉴定70-73
  • 3.5.4 共有抗原表位与抗禽、抗猪或抗人HEV阳性血清交叉反应73-74
  • 3.5.5 抗原表位保守性74-75
  • 3.5.6 抗原表位空间定位75-76
  • 3.5.7 抗原表位 3E8和 1B5对鸡没有保护性76-79
  • 3.6 讨论79-80
  • 3.7 小结80-81
  • 第四章 宿主细胞与诺如病毒VPg互作蛋白的鉴定81-101
  • 4.1 背景与意义81
  • 4.2 实验目的与研究路线81-82
  • 4.3 实验试剂与仪器82-83
  • 4.3.1 实验试剂82-83
  • 4.3.2 实验器材83
  • 4.4 实验方法83-88
  • 4.4.1 序列比对83
  • 4.4.2 构建GFP重组质粒83-84
  • 4.4.3 细胞同位素标记与培养84
  • 4.4.4 细胞转染84-86
  • 4.4.5 制备IP样品86
  • 4.4.6 免疫共沉淀86
  • 4.4.7 质谱检测86-87
  • 4.4.8 数据分析87
  • 4.4.9 验证IP结果87
  • 4.4.10 YBX1和G3BP1敲低对病毒感染和复制的影响87
  • 4.4.11 qPCR检测病毒RNA含量87-88
  • 4.5 实验结果88-99
  • 4.5.1 HuNoV和MNV VPg基因同源性分析并构建GFP标签重组质粒88-89
  • 4.5.2 GFP亲和纯化系统验证89-90
  • 4.5.3 质谱数据评估90-91
  • 4.5.4 筛选质谱获得与VPg相互作用蛋白91-93
  • 4.5.5 互作蛋白网络分析93-95
  • 4.5.6 宿主细胞中与VPg互作蛋白分析95-96
  • 4.5.7 验证互作靶蛋白96-97
  • 4.5.8 YBX1和G3BP1功能探究97-99
  • 4.6 讨论99-100
  • 4.7 本章小结100-101
  • 第五章 鼠诺如病毒VP2蛋白与宿主细胞互作蛋白的鉴定101-123
  • 5.1 研究背景与意义101-102
  • 5.2 研究目的与研究路线102-103
  • 5.2.1 研究目的102
  • 5.2.2 研究路线102-103
  • 5.3 实验试剂与仪器103
  • 5.3.1 实验试剂103
  • 5.3.2 实验器材103
  • 5.4 实验方法103-107
  • 5.4.1 细胞培养103-104
  • 5.4.2 同位素标记BV2细胞104
  • 5.4.3 拯救VP2-FLAG重组病毒104
  • 5.4.4 细胞转染104
  • 5.4.5 测定病毒滴度104
  • 5.4.6 纯化浓缩病毒104-105
  • 5.4.7 病毒感染细胞105-106
  • 5.4.8 FLAG亲和纯化106
  • 5.4.9 质谱检测106
  • 5.4.10 数据分析106
  • 5.4.11 制备转染VPg-linked RNA106-107
  • 5.4.12 免疫荧光共定位107
  • 5.5 实验结果107-121
  • 5.5.1 获得高滴度重组病毒107-108
  • 5.5.2 FLAG亲和纯化效果验证108-109
  • 5.5.3 质谱检测结果评估109-110
  • 5.5.4 设定质谱数据阳性判定值110-111
  • 5.5.5 宿主细胞中与VP2互作的靶蛋白111-114
  • 5.5.6 验证互作靶蛋白114-115
  • 5.5.7 免疫荧光共定位分析VP2在病毒代谢中细胞定位115-118
  • 5.5.8 宿主细胞中与Ns4或VP2互作靶蛋白分析118-120
  • 5.5.9 宿主细胞中与Ns1/2 或VP2互作靶蛋白分析120-121
  • 5.6 讨论121-122
  • 5.7 本章小结122-123
  • 全文总结123-124
  • 研究创新点124-125
  • 参考文献125-147
  • 致谢147-149
  • 作者简介149

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