收藏本站
《西北农林科技大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

藏猪肠道中拮抗致病菌微生物的筛选及其抗菌肽研究

辛海云  
【摘要】:抗生素的发明和使用,对人类和动物疾病防控发挥了极其重要的作用,但其广泛而超标应用导致了抗药菌株的产生,给人类和动物的健康造成极大的威胁。因而,研究和筛选抗生素的替代品成为国内外生命科学研究的热点。在众多研究中发现,抗菌肽具有广谱抗菌活性,对各种有害微生物、真菌、病毒的危害和肿瘤细胞的产生等均有很好的防控效果,而且很少产生耐药性,因而受到国内外研究者的高度青睐。藏猪又称为藏香猪,是我国青藏高原上常年放牧生长的宝贵地方品种,在长期严酷的自然环境条件下,形成了珍贵的抗寒、抗病、食草、肉香等优良特性,这些宝贵的优良特性必然与其肠道特殊的微生物区系有关,其肠道中存在的多种大量微生物群落相互拮抗又相互促进共生,为藏猪肠道提供了优良的微生态环境,分泌的各种维生素及多肽、蛋白等,发挥了促进健康和预防疾病的功能,同时,也为拮抗菌和抗菌物质的筛选提供了来源。基于此,我们以藏猪肠道微生物为研究对象,采取多种现代先进的生物技术,研究藏猪肠道内容物中是否存在拮抗病原菌的微生物,以及能否从筛选的拮抗菌中分离出有效的抑菌物质,如抗菌肽等。通过以下系列研究,获得如下试验结果:1、采用琼脂扩散法从藏猪的盲肠内容物中筛选出一株拮抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活性最强的细菌,经过对该菌株进行菌落观察、美蓝染色鉴定以及16S rDNA的比对和系统发育进化树分析,判定该菌株为枯草芽孢杆菌,并命名为Bacillus sublitis TS;发酵条件优化分析表明,最佳碳源为2%的玉米粉,最佳发酵起始pH值为6,最佳培养温度为30℃,接种后发酵至24h时其抑菌活性最高,抑菌物质的产量最高。检测发现,该菌发酵上清液具有不耐热、不耐蛋白酶K的特点,而且在中性环境下,抑菌活性最高。2、采用AKTA蛋白纯化系统及反相液相色谱系统,利用不同规格的反相液相色谱柱,包括ResourceTM RPC(3 mL)、Ultisil XB-C8、ZORBAX 300SB-C18色谱柱,结合超滤浓缩装置,逐步将分离筛选的拮抗菌种Bacillus sublitis TS发酵产生的抑菌活性物质进行分离纯化,得到了一种新型的天然抗菌肽TP(Tibetan-swine derived peptide)。其质谱分析表明,该纯化抗菌肽包含16个氨基酸,序列为ASVVNKLTGGVAGLLK,分子质量为1568.919 Da。在APD数据库中没有发现与其相同的氨基酸序列,因此命名为新型抗菌肽TP,在线预测显示其带有两个正电荷,疏水性氨基酸比例为50%,等电点为10,分子式为C68H124N18O20S0。另外,TP的二级结构预测结果各异,可能形成螺旋结构,疏水氨基酸和亲水氨基酸分别分布在螺旋结构的两面,也可能形成无规则卷曲结构,其确定的结构形式仍需做进一步的验证。3、采用MH琼脂平板法,研究了抗菌肽TP对多种G+和G-细菌的抑制效果,结果以最小抑菌浓度(MIC)表示。研究结果表明,TP的敏感菌株多为革兰氏阴性菌,阳性菌的敏感性较弱。以E.coli ATCC 25922为模型,探究了抗菌肽TP对细菌生长抑制的动态作用效果。在一定范围内,其作用时间越久,浓度越高,抑制效果越好,但对抑制大肠杆菌的传统多肽多粘菌素相比活性仍然较弱。TP处理E.coli ATCC 25922后发现:(1)在扫描电镜下观察,细胞表面完整性受到破坏;(2)邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)可以摄入细胞内,产生邻-硝基苯酚(ONP),表明TP可以增强E.coli ATCC 25922的细胞膜渗透性;(3)渗出细胞外的K+浓度增加,进一步证明了其渗透性增强,细胞膜结构被破坏。另外,体外竞争吸附试验表明,抗菌肽TP可以与EtBr竞争E.coli ATCC 25922基因组DNA碱基结合位点,结合力比EtBr对DNA的结合力更强。表明抗菌肽TP在杀菌过程中,增加细胞膜通透性,破坏膜结构,并有可能进入细菌细胞,结合胞内的DNA,使其DNA活性受阻。4、为检验TP对红细胞的毒性,采用细胞溶血性分析方法,检验抗菌肽TP对小鼠红细胞的毒性。结果表明,TP在320μM浓度下仍然有15%左右的溶血性,但与对照组PBS处理的溶血性相比差异不显著,而极显著低于1%Triton X-100处理后的溶血性(100%)(p0.01)。MTT分析结果表明,TP对原代绒山羊胎儿成纤维细胞的IC50=71.323μM的浓度比TP最敏感菌株的MIC(2.5–10μM)都要高。TP抑制人胃癌细胞系MKN-45和急性早幼粒白血病细胞系NB4的IC50浓度分别为4.686μM和11.479μM。NB4细胞使用TP处理后,提取RNA并进行实时定量分析,其癌细胞凋亡相关基因Bax表达量上升,Bcl2表达量下降,表明TP处理后癌细胞出现凋亡症状。因而TP对红细胞毒性小,对哺乳动物体细胞有轻微毒性,对癌细胞有抑制生长作用。该试验结果可应用于后续的临床检验和畜牧业生产。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.6

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;日本利用咖啡渣培育拮抗菌[J];世界热带农业信息;2004年07期
2 黄丽婵;欧阳涟;刘文群;韩伟;杨光;;拮抗菌对柑橘霉变及其抗性的影响[J];食品科学;2008年11期
3 柳少燕;陈捷胤;李蕾;戴小枫;;拮抗菌与病原菌碳水化合物酶类比较分析[J];基因组学与应用生物学;2013年01期
4 康金花,王林霞;瓜类枯萎镰刀菌拮抗菌筛选的初步研究[J];干旱区研究;1997年02期
5 王林霞,康金花;抑制镰刀菌生长的土壤拮抗菌的筛选[J];干旱区研究;1997年04期
6 马平,李社增,陈新华,刘增志,杜嘉贞;利用拮抗菌防治棉铃疫病[J];中国生物防治;1998年02期
7 刘新涛;倪云霞;刘玉霞;刘红彦;;拮抗菌96-79发酵培养基的优化[J];河南农业科学;2007年06期
8 周秀华;崔磊;武术杰;刘菊秋;;三种拮抗菌对苗木立枯病病原菌的影响[J];北方园艺;2011年24期
9 刘亚楠;习丙文;梁利国;谢骏;朱健;;水产动物病原菌拮抗菌的研究进展[J];江苏农业科学;2013年05期
10 楼兵干,张炳欣,陆元昶;黄瓜品种与其根围主要病原菌的拮抗菌之间关系的研究[J];浙江农业大学学报;1998年S1期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘玉霞;倪云霞;刘新涛;刘红彦;王飞;;植物病原菌拮抗菌的筛选[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年
2 郝变青;马利平;高芬;乔雄梧;;拮抗菌98-Ⅱ在极端条件下的生物量及其生物活性测定[A];中国植物病理学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2002年
3 高新明;李本金;赵健;兰成忠;陈庆河;翁启勇;;一株番石榴焦腐病拮抗菌的初步报道[A];中国植物病理学会2011年学术年会论文集[C];2011年
4 孙琳琳;蒋继志;宫卫波;郄亚卿;;胶胞炭疽菌拮抗菌及其抗生物质的初步探讨[A];中国植物病理学会2006年学术年会论文集[C];2006年
5 唐贵群;文成敬;邹勇;李宁;候浪;;四株绿色粘帚霉拮抗菌生物学特性研究[A];农业生物灾害预防与控制研究[C];2005年
6 蔡少芬;温志强;张婷;温建荣;;菌盖疣孢霉菌拮抗菌的初步鉴定[A];中国菌物学会第四届会员代表大会暨全国第七届菌物学学术讨论会论文集[C];2008年
7 周登博;舒灿伟;钟兴鹏;周而勋;;立枯丝核菌拮抗菌的筛选及其拮抗物质研究[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
8 万亚坤;田世平;徐勇;;G418抗性作为外源基因在拮抗菌膜醭毕赤酵母中表达的显性选择标记[A];中国植物学会七十周年年会论文摘要汇编(1933—2003)[C];2003年
9 郝变青;马利平;乔雄梧;张丽珍;;表达gfp的拮抗菌96-Ⅱ启动子克隆的关键因素[A];中国微生物学会《第二届全国农业微生物研究及产业化研讨会》和《第十一届全国杀虫微生物学术研讨会》暨《湖北省暨武汉市微生物学会和内蒙古微生物学会2008年会》论文摘要[C];2008年
10 刘翠平;陈国康;黄芸;肖崇刚;;根肿菌拮抗菌的分离及初步筛选[A];“创新驱动与现代植保”——中国植物保护学会第十一次全国会员代表大会暨2013年学术年会论文集[C];2013年
中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 辛海云;藏猪肠道中拮抗致病菌微生物的筛选及其抗菌肽研究[D];西北农林科技大学;2017年
2 万亚坤;酵母拮抗菌的抑病机理及生防效力改良的研究[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2004年
3 王友升;酵母拮抗菌的抑病效力、规模化培养及相关机理研究[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2005年
4 李博强;海藻糖提高酵母拮抗菌生活力和生防效力的作用机制[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2006年
5 姚红杰;拮抗菌和化学物质的抑病机理及果实抗病相关基因的克隆[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2005年
6 产祝龙;果实对酵母拮抗菌和外源水杨酸诱导的抗病性应答机理[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2006年
7 薛梦林;拮抗菌对冬枣采后病害的生物防治[D];西北农林科技大学;2006年
8 金光;海洋拮抗菌JG1的分离鉴定、应用及热激蛋白DnaK的保护机制初探[D];中国海洋大学;2010年
9 周莉娟;GFP在南方根结线虫(Meloidogyne incogita)拮抗菌Alcaligenes faecalis研究中的应用[D];福建农林大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 崔郑龙;棉花枯萎病菌拮抗菌的筛选和抑菌机理初探[D];石河子大学;2015年
2 石建龙;贵州半夏块茎腐烂病病原菌的分离鉴定及其拮抗菌师选[D];贵阳医学院;2015年
3 檀迎会;层出镰孢拮抗菌的分离筛选及发酵条件优化[D];河北农业大学;2015年
4 卢维浩;荧光标记腐败菌PJ-9拮抗菌的筛选、鉴定与发酵条件优化研究[D];南京农业大学;2014年
5 李文卓;灿烂弧菌拮抗菌筛选及拮抗菌抑菌物质的研究[D];大连工业大学;2013年
6 胡晓丹;禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选鉴定及拮抗特性研究[D];南京农业大学;2014年
7 王壮;五味子叶枯病菌拮抗菌筛选、分离鉴定及其发酵特性研究[D];吉林农业大学;2016年
8 宋晓兰;有机肥对烟田微生物群落影响及青枯病拮抗菌筛选[D];贵州大学;2016年
9 郭聪;海南凡纳滨对虾机体内三种常见弧菌鉴定、分子血清型研究及其拮抗菌筛选[D];海南大学;2016年
10 黄颖倩;草莓病原菌及其拮抗菌的筛选、鉴定与抑菌特性初探[D];山东农业大学;2016年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026