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《西北农林科技大学》 2017年
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CRISPR/Cas9高效等位基因编辑系统的构建及其在猪基因组编辑中的应用研究

吴芸  
【摘要】:基因组编辑是借助于细胞自身的DNA损伤修复机制对目标基因序列进行碱基删除、插入或突变的基因组操作过程。早期仅依靠自发性同源重组的基因组编辑效率极低,直到人工核酸酶出现,由人工核酸酶定点切割DNA产生双链断裂,激活体内DNA修复机制进行定点的基因组编辑,极大的提高了编辑的效率。随着测序技术的不断发展,一些基因得到注释,基因功能的研究成为重点和热点,目前研究基因功能的手段主要是基因修饰技术。近年来,CRISPR/Cas9核酸酶以其简单、快捷、高效的特点迅速发展,广泛运用于不同种类细胞的基因组修饰。精准的定点基因组编辑技术不仅能推进基因功能的研究,用于构建人类疾病模型、基因治疗,还能加快动物的遗传改良。双等位基因基因组修饰细胞的获得费时、费力且效率很低,目前这仍然是基因组编辑技术中的一个难点。本研究开发了一套CRISPR/Cas9高效等位基因编辑系统。该系统有效整合了基因编辑阳性细胞富集报告系统(Surrogate Reporter,Rep)与含有sgRNA的供体系统(Donor,Don)。其特点是既能作为供体提供修复的模板,又能作为报告系统反应核酸酶的活性和靶位点整合的效率。首先在哺乳动物细胞中对该系统(Rep/Don)进行了概念验证,结果显示双等位基因位点的基因敲入效率得到了显著提高。随后用Rep/Don打靶系统在猪PK15细胞上对lnc-sscg3623基因进行了基因编辑研究,同样获得了高效双等位基因位点的编辑结果。1.构建用于哺乳动物细胞基因组编辑的三个整合系统Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR。其中Rep/Don PG系统中包含一个抗性基因(puror)和一个荧光蛋白基因(eGFP),两个基因通过剪切肽(T2A)连接(Puror-eGFP)。与前述整合系统类似,Rep/Don NR和Rep/Don ZR系统中分别含有Neor-mRFP和Zeor-mRFP元件。三个整合系统中每个抗性基因编码区分别插入了CRISPR/Cas9的靶位点序列,该靶位点序列的两端含有200 bp的抗性基因重复片段,从而构成了SSA(Single Strand Annealing)结构,当CRISPR/Cas9核酸酶对靶序列进行切割后,产生载体DNA的双链断裂,诱导细胞内DNA损伤修复机制的激活。从而对载体进行SSA介导的损伤修复,修复的结果导致抗性基因的阅读框恢复正常表达。除了对整合系统中的报告基因进行靶向切割外,CRISPR/Cas9同时对细胞基因组上的靶位点进行切割,由于整合载体中含有基因组上靶位点的同源序列,细胞对基因组DNA的损伤将会通过同源重组(Homologous Directed Repair,HDR)修复机制以载体为模板进行修复,通过对修复后的抗性基因筛选,能够实现对基因组编辑后的阳性细胞富集。由于两个等位基因位点上整合了含有不同抗性基因的供体,因此同时对两个抗性基因的筛选能够实现对双等位基因位点编辑细胞的富集。2.将构建的Rep/Don PG和Rep/Don ZR打靶系统在HEK293T细胞上对目标基因CCR5进行了编辑,结果表明,Rep/Don PG和Rep/Don ZR单系统的双敲效率分别是2.33%和2.08%,Rep/Don PG+ZR的双敲效率为34.09%。3.通过药物杀伤实验确定嘌呤霉素(Puromycin)、G418和博莱霉素(Zeocin)这三种抗生素药物在猪PK15细胞中的最佳工作浓度。嘌呤霉素的最佳筛选浓度是1μg/mL,G418是1200μg/mL,博莱霉素为400μg/mL。4.设计三条猪lncRNA基因lnc-sscg3623的sgRNA,构建了相应的CRISPR/Cas9表达载体和RPG报告载体,共转染HEK293T细胞后通过绿色荧光蛋白报告基因的表达,初步判别sgRNA的效率,选择了活性较高的sgRNA Tar2和sgRNA Tar1用于后续实验。5.构建了用于编辑猪lnc-sscg3623基因两个靶位点Tar2和Tar1的Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR打靶系统及对应的CRISPR/Cas9打靶载体。在lnc-sscg3623基因Tar1位点,Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR单个打靶系统在猪PK15细胞系中的单敲效率分别为:25%、37.5%和26.32%。Rep/Don PG+ZR的双敲效率为:10%。在Tar2位点,经过各打靶系统对应的抗生素(嘌呤霉素、G418和博莱霉素)筛选后,得到敲入的阳性细胞,三个单系统Rep/Don PG、Rep/Don NR、Rep/Don ZR的单敲效率分别为:75%、65%和64.86%;双敲效率分别是:6.81%、7.5%和2.7%。lnc-sscg3623Tar2.Rep/Don PG+NR双系统的靶向双敲效率为16.67%,lnc-sscg3623Tar2.Rep/Don PG+ZR双系统双敲效率为18.18%。本研究开发了一套CRISPR/Cas9高效等位基因编辑系统,为基因功能研究、畜禽经济性状改良提供了研究基础。
【关键词】:CRISPR/Cas9 Rep/Don打靶系统 基因敲入 双敲效率
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;S828
【目录】:
  • 摘要6-8
  • Abstract8-13
  • 第一章 文献综述13-30
  • 1.1 基因组编辑13-14
  • 1.2 人工核酸内切酶14-23
  • 1.2.1 锌指核酸酶15-16
  • 1.2.2 类转录激活因子核酸酶16-18
  • 1.2.3 CRISPR/Cas9核酸酶18-23
  • 1.3 CRISPR/Cas9介导的定点修饰技术在动物中的应用23-29
  • 1.3.1 CRISPR/Cas9技术在畜禽生产性能改良上的应用24-26
  • 1.3.2 CRISPR/Cas9技术在畜禽功能基因上的应用26-27
  • 1.3.3 CRISPR/Cas9技术在畜禽用疾病模型和生物医学上的应用27-29
  • 1.4 本研究的目的意义29-30
  • 第二章 Rep/Don打靶系统的构建30-48
  • 2.1 试验材料31-33
  • 2.1.1 菌株、细胞系及质粒31-32
  • 2.1.2 试剂32
  • 2.1.3 试剂配制32
  • 2.1.4 主要仪器设备32
  • 2.1.5 引物32-33
  • 2.2 试验方法33-40
  • 2.2.1 Rep/Don PG载体构建33
  • 2.2.2 CCR5靶位点Rep/Don PG载体的构建33-36
  • 2.2.3 Rep/Don NR载体构建36-39
  • 2.2.4 CRISPR/Cas9表达载体的构建39
  • 2.2.5 细胞培养39-40
  • 2.2.6 细胞转染40
  • 2.3 试验结果40-46
  • 2.3.1 Rep/Don载体系统的构建40-42
  • 2.3.2 Rep/Don NR载体42-44
  • 2.3.3 CRISPR/Cas9核酸酶活性验证44-45
  • 2.3.4 Rep/Don PG和Rep/DonNR载体系统工作验证45-46
  • 2.4 讨论46-47
  • 2.5 小结47-48
  • 第三章 Rep/Don打靶系统的优化及其在HEK293细胞上的应用48-76
  • 3.1 试验材料49-50
  • 3.1.1 菌株、细胞及质粒49
  • 3.1.2 试剂49
  • 3.1.3 试剂配制49
  • 3.1.4 主要仪器设备49-50
  • 3.1.5 引物50
  • 3.2 试验方法50-56
  • 3.2.1 细胞培养50
  • 3.2.2 细胞转染50
  • 3.2.3 CCR5基因CCR5a靶位点Rep/Don PG载体的构建50-52
  • 3.2.4 Rep/Don ZR载体52-54
  • 3.2.5 嘌呤霉素筛选阳性细胞54
  • 3.2.6 G418筛选阳性细胞54
  • 3.2.7 博莱霉素用于细胞筛选54-55
  • 3.2.8 嘌呤霉素和博莱霉素共同筛选阳性细胞55
  • 3.2.9 流式细胞仪检测Rep/Don打靶系统效率55
  • 3.2.10 单克隆细胞基因组DNA PCR分型检测55-56
  • 3.3 试验结果56-72
  • 3.3.1 Rep/Don系统在HEK293A细胞基因组CCR5基因位点的敲入56-57
  • 3.3.2 细胞克隆基因组DNA的PCR分型检测57-59
  • 3.3.3 测序检测细胞基因组DNA CCR5基因靶位点59
  • 3.3.4 pXL-CCR5a 515382 \h l载体的构建59-61
  • 3.3.5 Rep/Don ZR载体系统的构建61-63
  • 3.3.6 CCR5a.Rep/Don PG载体的构建63-64
  • 3.3.7 CCR5a.Rep/Don PG和CCR5a.Rep/DonZR载体系统工作验证64-65
  • 3.3.8 CRISPR/Cas9打靶后SSA的修复效率65-66
  • 3.3.9 用于HEK293T细胞筛选的博莱霉素最佳浓度66-67
  • 3.3.10 嘌呤霉素和博莱霉素筛选细胞67-68
  • 3.3.11 Rep/Don打靶系统在哺乳动物细胞基因组水平工作效率的检测68-72
  • 3.4 讨论72-74
  • 3.5 小结74-76
  • 第四章 Rep/Don打靶系统靶向编辑猪lnc-sscg3623基因76-116
  • 4.1 试验材料76-78
  • 4.1.1 菌株、细胞系及质粒76-77
  • 4.1.2 试剂77
  • 4.1.3 试剂配制77
  • 4.1.4 主要仪器设备77
  • 4.1.5 引物77-78
  • 4.2 实验方法78-86
  • 4.2.1 lnc-sscg3623基因CRISPR/Cas9核酸酶靶位点的选择78-79
  • 4.2.2 lnc-sscg3623基因RPG载体的构建79
  • 4.2.3 CRISPR/Cas9表达载体的构建79-80
  • 4.2.4 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don PG载体的构建80-81
  • 4.2.5 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don NR载体的构建81-82
  • 4.2.6 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don ZR载体的构建82
  • 4.2.7 细胞培养82
  • 4.2.8 细胞转染82-83
  • 4.2.9 嘌呤霉素筛选细胞83-84
  • 4.2.10 G418筛选细胞84
  • 4.2.11 博莱霉素用于细胞筛选84
  • 4.2.12 两种抗生素药物同时筛选细胞84-85
  • 4.2.13 细胞基因组提取及PCR扩增鉴定85-86
  • 4.3 试验结果86-113
  • 4.3.1 lnc-sscg3623基因RPG载体的构建86
  • 4.3.2 lnc-sscg3623基因的CRISPR/Cas9表达载体构建86-87
  • 4.3.3 lnc-sscg3623基因三个靶位点效率的检测87-88
  • 4.3.4 lnc-sscg3623基因两靶位点串连的报告载体和Csa9表达载体的构建88-90
  • 4.3.5 一个靶位点与两个靶位点串连的效率比较90-91
  • 4.3.6 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don PG载体的构建91-95
  • 4.3.7 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don NR载体的构建95-98
  • 4.3.8 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don ZR载体的构建98-100
  • 4.3.9 嘌呤霉素作用于PK15细胞的最佳浓度100-101
  • 4.3.10 G418最佳工作浓度的确定101-102
  • 4.3.11 博莱霉素最佳工作浓度的确定102-103
  • 4.3.12 三种抗生素筛选细胞103-105
  • 4.3.13 Rep/Don打靶系统在lnc-sscg3623基因Tar1基因组水平工作效率检测105-108
  • 4.3.14 Rep/Don打靶系统在lnc-sscg3623基因Tar2基因组水平工作效率的检测108-113
  • 4.4 讨论113-114
  • 4.5 小结114-116
  • 结论与创新点116-117
  • 参考文献117-129
  • 缩略词129-130
  • 致谢130-131
  • 作者简介131

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