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《西北农林科技大学》 2017年
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用单分子方法研究解旋酶与G4 DNA的作用机理

武文强  
【摘要】:解旋酶(Helicase)是一类通过水解三磷酸核苷(通常是三磷酸腺苷(ATP))打开核酸之间氢键的马达蛋白。其广泛存在于每个物种中并且几乎参与了核酸代谢的各个方面。解旋酶突变将会导致核酸代谢紊乱,甚至会导致严重的遗传性疾病,如人类RecQ家族解旋酶RecQ2/Bloom(BLM)、RecQ3/Werner(WRN)、RecQ4/RTS突变将会分别导致BLM综合征、WRN综合征和Rothmund-Thomson综合征。这些病人通常表现为基因组不稳定及易患癌症。解旋酶不仅可以解旋传统的双链结构,还可以解旋Holliday连接体、G-四链体(G-quadruplex,G4)等复杂结构。G4是一类非常规的核酸高级结构。其基本组成单元是四个鸟苷酸通过Hoogsteen氢键形成的平面。当不少于两个鸟苷酸平面被Na+或K+稳定,就形成了G4。G4 DNA在复制、转录、端粒代谢等生物过程中都发挥了极其重要的作用,所以如果G4不能被正确处理将会导致各种疾病。G4的生物功能是通过动态的折叠和打开实现的。在细胞内,G4可以自发折叠,但其打开是由专门的解旋酶来完成的,例如Pif1、FancJ、BLM、WRN等。在体外理解这类解旋酶解旋G4 DNA的机制以及G4 DNA对这类解旋酶的影响有助于预测其在体内的行为,然后了解它们的生物功能。但由于研究手段的限制,解旋酶与G4 DNA相互作用的分子机理尚不清楚。近二十年来,单分子技术(例如光镊、磁镊、单分子荧光共振能量转移)的进步极大地提升了我们实时观察解旋酶与核酸相互作用的能力。本文利用单分子荧光共振能量转移技术的优势,系统地探究了解旋酶Pif1、BLM和WRN与G4 DNA的相互作用,揭示了前所未有的反应细节。Pif1与G4 DNA相互作用的实验结果表明:(1)Pif1以位移的方式分步并且往复打开G4 DNA;(2)Pif1往复打开G4受到ATP浓度的调节;(3)Pif1往复打开G4不需要5’尾链;(4)Pif1以单体形式打开G4;(5)G-三链体在Pif1往复打开G4过程中发挥重要作用;(6)高浓度Pif1解旋双链DNA前表现出短暂停顿的现象,对应着Pif1同源二聚体的形成;(7)G4可以明显缩短Pif1解旋双链DNA的等待时间;(8)G4促进解旋的现象在复制叉处表现的更为明显;(9)更高浓度的Pif1通过加快二聚化减少等待时间;(10)富含G的序列而不是G4结构促进Pif1解旋下游双链。BLM与G4 DNA相互作用的实验结果表明:(1)G4 DNA在生理条件下可以折叠成两种结构,并且Mg2+也可以稳定G4结构;(2)BLM解旋G4是依赖于ATP的;(3)当G4 3’末端只含有单链DNA的情况下,BLM分步阶梯式以G-三链体、G-发卡结构为中间状态打开G4 DNA;(4)当G4 3’端通过一段单链DNA连接双链DNA的情况下,BLM锚定在单双链叉口抽动单链DNA,挤出单链DNA环,循环打开G4 DNA;(5)BLM打开G4结构的能力较弱,不能打开稳定的四层G4结构,同时G4是BLM位移的障碍。WRN与G4 DNA相互作用的实验结果表明:(1)WRN在叉状、单双链和含有G4的DNA结构上表现出循环解旋现象,显示出表观持续解旋能力弱;(2)WRN可以锚定在单双链叉口抽动5’单链DNA,诱导单链DNA往复成环;(3)循环解旋来自相同WRN沿着同一条单链DNA的往复运动,而不是不同解旋酶的解离和结合,或相同解旋酶的链转换;(4)G4在不同结构环境下均表现出阻挡WRN位移和解旋下游双链的现象;(5)G4序列的互补链或G4 3’端多出的双链锚定位点可以促进WRN解旋G4下游的双链DNA。总之,上述解旋酶解旋G4过程中均表现出分步解旋和循环解旋的现象但分子机理不同。而对于不同的解旋酶来说,G4对于下游双链DNA解旋的影响有时表现为激活有时表现出抑制。
【关键词】:单分子 G4 Pif1 BLM WRN
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q75
【目录】:
  • 摘要5-7
  • Abstract7-12
  • 第一章 文献综述12-32
  • 1.1 解旋酶12-20
  • 1.1.1 解旋酶概述12-13
  • 1.1.2 解旋酶的分类13-15
  • 1.1.3 解旋酶的性质15-16
  • 1.1.4 解旋酶的工作模型16-20
  • 1.2 单分子技术20-24
  • 1.2.1 单分子概述20-21
  • 1.2.2 磁镊21-22
  • 1.2.3 光镊22-23
  • 1.2.4 单分子荧光23-24
  • 1.3 G4 DNA及其解旋酶24-31
  • 1.3.1 G4 DNA及功能24-26
  • 1.3.2 G4 DNA的物化性质26-27
  • 1.3.3 G4 DNA解旋酶及进展27-29
  • 1.3.4 G4研究手段及进展29-31
  • 1.4 研究目的和意义31-32
  • 第二章 单分子荧光共振能量转移32-41
  • 2.1 全内反射荧光显微镜32-33
  • 2.2 单分子荧光共振能量转移原理及进展33-35
  • 2.2.1 原理简介33
  • 2.2.2 荧光对选择33-34
  • 2.2.3 技术进展34-35
  • 2.3 单分子荧光显微镜构建35-37
  • 2.4 实验步骤37-41
  • 2.4.1 准备工作37
  • 2.4.2 样品池制备37-39
  • 2.4.3 实验过程39-41
  • 第三章 Pif1解旋G4以及G4激活下游双链解旋的机理41-68
  • 引言41
  • 3.1 材料与方法41-46
  • 3.1.1 材料41-44
  • 3.1.2 方法44-46
  • 3.2 结果与分析46-65
  • 3.2.1 Pif1p催化的G4 DNA往复打开和折叠46-51
  • 3.2.2 Pif1p往复打开G4受到ATP浓度调节51-52
  • 3.2.3 Pif1p打开没有尾链的G452-53
  • 3.2.4 Pif1p以单体形式打开G453
  • 3.2.5 Pif1p解旋G4的分子机制53-56
  • 3.2.6 高浓度Pif1p解旋双链DNA前表现出等待56-58
  • 3.2.7 G4明显缩短等待时间58-59
  • 3.2.8 高浓度Pif1p通过二聚化减少等待时间59-61
  • 3.2.9 富含G序列促进Pif1p解旋下游双链61-64
  • 3.2.10 G4在复制叉处促进解旋更明显64-65
  • 3.3 讨论65-68
  • 第四章 BLM解旋酶与G4 DNA相互作用的现象及机理68-87
  • 引言68
  • 4.1 材料与方法68-70
  • 4.1.1 材料68-70
  • 4.1.2 方法70
  • 4.2 结果与分析70-85
  • 4.2.1 BLM催化G4打开依赖于ATP70-72
  • 4.2.2 BLM分步阶梯式打开dG4s72-73
  • 4.2.3 高浓度ATP情况下BLM与dG4s反应的性质73-77
  • 4.2.4 BLM催化的G4sd解旋77-78
  • 4.2.5 G4sd的一步降低是BLM结合而不是G4打开78-80
  • 4.2.6 BLM循环抽动单链DNA及其性质80-84
  • 4.2.7 重新思考BLM的链转换行为84-85
  • 4.3 讨论85-87
  • 第五章 WRN解旋酶与DNA相互作用的现象及机理87-108
  • 引言87
  • 5.1 材料与方法87-90
  • 5.1.1 材料87-89
  • 5.1.2 方法89-90
  • 5.2 结果与分析90-106
  • 5.2.1 WRN与叉状结构的反应90-93
  • 5.2.2 WRN沿着单链DNA往复运动93-98
  • 5.2.3 WRN诱导 5’单链DNA环化98-102
  • 5.2.4 G4结构调节WRN在不同结构环境中的活性102-105
  • 5.2.5 G4互补链和额外锚定位点加速解旋的机制105-106
  • 5.3 讨论106-108
  • 第六章 结论108-109
  • 参考文献109-127
  • 附录127-128
  • 缩略词128-129
  • 致谢129-130
  • 作者简介130

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