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《西北农林科技大学》 2017年
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用单分子方法研究解旋酶与G4 DNA的作用机理

武文强  
【摘要】:解旋酶(Helicase)是一类通过水解三磷酸核苷(通常是三磷酸腺苷(ATP))打开核酸之间氢键的马达蛋白。其广泛存在于每个物种中并且几乎参与了核酸代谢的各个方面。解旋酶突变将会导致核酸代谢紊乱,甚至会导致严重的遗传性疾病,如人类RecQ家族解旋酶RecQ2/Bloom(BLM)、RecQ3/Werner(WRN)、RecQ4/RTS突变将会分别导致BLM综合征、WRN综合征和Rothmund-Thomson综合征。这些病人通常表现为基因组不稳定及易患癌症。解旋酶不仅可以解旋传统的双链结构,还可以解旋Holliday连接体、G-四链体(G-quadruplex,G4)等复杂结构。G4是一类非常规的核酸高级结构。其基本组成单元是四个鸟苷酸通过Hoogsteen氢键形成的平面。当不少于两个鸟苷酸平面被Na+或K+稳定,就形成了G4。G4 DNA在复制、转录、端粒代谢等生物过程中都发挥了极其重要的作用,所以如果G4不能被正确处理将会导致各种疾病。G4的生物功能是通过动态的折叠和打开实现的。在细胞内,G4可以自发折叠,但其打开是由专门的解旋酶来完成的,例如Pif1、FancJ、BLM、WRN等。在体外理解这类解旋酶解旋G4 DNA的机制以及G4 DNA对这类解旋酶的影响有助于预测其在体内的行为,然后了解它们的生物功能。但由于研究手段的限制,解旋酶与G4 DNA相互作用的分子机理尚不清楚。近二十年来,单分子技术(例如光镊、磁镊、单分子荧光共振能量转移)的进步极大地提升了我们实时观察解旋酶与核酸相互作用的能力。本文利用单分子荧光共振能量转移技术的优势,系统地探究了解旋酶Pif1、BLM和WRN与G4 DNA的相互作用,揭示了前所未有的反应细节。Pif1与G4 DNA相互作用的实验结果表明:(1)Pif1以位移的方式分步并且往复打开G4 DNA;(2)Pif1往复打开G4受到ATP浓度的调节;(3)Pif1往复打开G4不需要5’尾链;(4)Pif1以单体形式打开G4;(5)G-三链体在Pif1往复打开G4过程中发挥重要作用;(6)高浓度Pif1解旋双链DNA前表现出短暂停顿的现象,对应着Pif1同源二聚体的形成;(7)G4可以明显缩短Pif1解旋双链DNA的等待时间;(8)G4促进解旋的现象在复制叉处表现的更为明显;(9)更高浓度的Pif1通过加快二聚化减少等待时间;(10)富含G的序列而不是G4结构促进Pif1解旋下游双链。BLM与G4 DNA相互作用的实验结果表明:(1)G4 DNA在生理条件下可以折叠成两种结构,并且Mg2+也可以稳定G4结构;(2)BLM解旋G4是依赖于ATP的;(3)当G4 3’末端只含有单链DNA的情况下,BLM分步阶梯式以G-三链体、G-发卡结构为中间状态打开G4 DNA;(4)当G4 3’端通过一段单链DNA连接双链DNA的情况下,BLM锚定在单双链叉口抽动单链DNA,挤出单链DNA环,循环打开G4 DNA;(5)BLM打开G4结构的能力较弱,不能打开稳定的四层G4结构,同时G4是BLM位移的障碍。WRN与G4 DNA相互作用的实验结果表明:(1)WRN在叉状、单双链和含有G4的DNA结构上表现出循环解旋现象,显示出表观持续解旋能力弱;(2)WRN可以锚定在单双链叉口抽动5’单链DNA,诱导单链DNA往复成环;(3)循环解旋来自相同WRN沿着同一条单链DNA的往复运动,而不是不同解旋酶的解离和结合,或相同解旋酶的链转换;(4)G4在不同结构环境下均表现出阻挡WRN位移和解旋下游双链的现象;(5)G4序列的互补链或G4 3’端多出的双链锚定位点可以促进WRN解旋G4下游的双链DNA。总之,上述解旋酶解旋G4过程中均表现出分步解旋和循环解旋的现象但分子机理不同。而对于不同的解旋酶来说,G4对于下游双链DNA解旋的影响有时表现为激活有时表现出抑制。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q75

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