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《兰州大学》 2017年
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基于多肽自组装技术构建内吗啡肽-1前药纳米传递系统及其脑靶向研究

赵晓宁  
【摘要】:内吗啡肽-1(Endomorphin-1,EM-1)为中枢神经系统(central nervous system,CNS)μ阿片受体的内源性配体,是一种理想的镇痛多肽药物,它具有与吗啡同等的镇痛效果,对于急性疼痛有强烈的抑制作用,且不易产生机体耐受、成瘾等严重副作用。但是由于EM-1分子水溶性好,给药后体内半衰期短、酶解稳定性差且难以透过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB),限制了EM-1在临床上的应用。本实验基于多肽自组装技术,创新地将多肽药物EM-1作为递送系统的一部分,通过单一插入二硫键,酯化构建一种多肽前药分子纳米结构,并进行脑靶向递送研究。实验使用不同长度的亲脂性烷基碳链(C8、C12、C_(18)),通过共价连接对亲水性EM-1进行酯化修饰,两亲端通过二硫键(-SS-)及酰胺键(-CONH-)接合,考察不同酯化程度及连接键对后续自组装纳米结构的影响。实验成功合成并纯化得到C8-SS-EM1、C12-SS-EM1、C_(18)-SS-EM1及C_(18)-CONH-EM1四种纯度较高的EM-1两亲性前药分子。通过传统的纳米-沉淀法,使四种两亲性前药分子自组装形成纳米颗粒(Nano-particles,NP)水溶液,通过透射电镜(TEM)、粒度仪、圆二色谱(CD)仪、动力学模拟(MD)等仪器对纳米形态、粒径、二级空间结构以及前药分子自组装行为进行表征,结果显示,四种前药分子形成的微观形态各有不同,相对而言,亲脂端碳链越长形成的NP粒径越小、形态均一且体系稳定,同样的,相对酰胺键,含有二硫键的前药分子形成的NP体系总体特征较好,MD结果表明两亲性前药分子自组装形成NP的行为符合胶束形成原理,即自组装形成了纳米胶束。小鼠温浴甩尾镇痛实验从药效学角度表明,相对母药EM-1,前药NP镇痛效果均得到改善,酯化修饰程度越高,镇痛效果越好,表明前药NP透过了BBB并且发挥镇痛活性。近红外活体动物成像以及离体脑组织荧光成像实验用于直观观测EM-1前药NP是否达到脑部,结果显示,裸鼠脑部均可以观测到包载有荧光探针DIR的四种前药NP的荧光信号,C_(18)-SS-EM1 NP信号最强且持续时间最长,再次验证前药NP能够透过BBB,且穿透能力同时受酯化程度和连接键影响。酶解稳定性实验用于考察EM-1及其前药NP在血浆及脑组织匀浆中受蛋白酶降解的情况,结果显示:相对于母药EM-1,酯化并自组装成NP的血液和脑组织酶解稳定性均显著提高;相对于酰胺键,二硫键的引入更易使母药EM-1从脑部释放出来发挥药效。体内药动学实验用于考察酯化前药C_(18)-SS-EM1 NP在体内的分布情况,结果显示C_(18)-SS-EM1分子不仅能分布到血浆及肝脏,也能吸收入脑。本研究以促进EM-1透过BBB发挥镇痛效果为目标,通过将EM-1酯化修饰形成两亲性前药分子,并且结合自组装技术形成纳米传递系统。聚集形成的NP有助于降低多肽药物的酶解作用、酯化修饰增强了整体分子的脂溶性、采用血液中稳定但脑内易断裂的二硫键,这些策略单独使用均可以提高多肽药物的脑摄取量,本实验成功构建的前药自组装NP起到了一举三得的效果。该技术渴望应用于神经肽类药物的脑靶向递送研究,为促进该类药物BBB通透性进行了有益的探索。
【关键词】:内吗啡肽-1 自组装 纳米颗粒 脑靶向 酯化前药
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R943
【目录】:
  • 中文摘要3-5
  • Abstract5-11
  • 第一章 前言11-19
  • 1.1 血脑屏障11-13
  • 1.1.1 血脑屏障的生理结构11
  • 1.1.2 药物透过血脑屏障的方法11-13
  • 1.2 多肽物质克服血脑屏障的研究进展及局限13-15
  • 1.2.1 多肽物质克服血脑屏障的研究进展13-15
  • 1.2.2 多肽药物克服血脑屏障的局限15
  • 1.3 多肽自组装纳米技术的分类及其在克服血脑屏障方面的应用15-17
  • 1.3.1 自组装纳米多肽的类型及结构16-17
  • 1.3.2 自组装纳米多肽克服血脑屏障的应用17
  • 1.4 内吗啡肽-1(EM-1)的研究进展17-18
  • 1.5 实验的创新性18-19
  • 第二章 EM-1 及其酯化多肽前药分子的合成及纯化19-27
  • 2.1 设计思路19-20
  • 2.2 实验材料20-21
  • 2.2.1 试剂及药品20-21
  • 2.2.2 仪器21
  • 2.3 实验方法21-24
  • 2.3.1 C_8-SS-COOH、C_(12)-SS-COOH、C_(18)-SS-COOH的合成及纯化21-22
  • 2.3.2 C_8-SS-EM1、C_(12)-SS-EM1、C_(18)-SS-EM1及C_(18)-CONH-EM1的合成及纯化22-24
  • 2.4 实验结果24-25
  • 2.4.1 C_8-SS-COOH、C_(12)-SS-COOH、C_(18)-SS-COOH的合成及纯化24
  • 2.4.2 C_8-SS-EM1、C_(12)-SS-EM1、C_(18)-SS-EM1及C_(18)-CONH-EM1的合成及纯化24-25
  • 2.5 讨论与结论25-27
  • 2.5.1 实验讨论25
  • 2.5.2 实验结论25-27
  • 第三章 EM-1 酯化多肽前药自组装纳米颗粒(NP)的配制及理化表征27-34
  • 3.1 设计思路27
  • 3.2 实验材料27-28
  • 3.2.1 试剂及药品27
  • 3.2.2 仪器27-28
  • 3.3 实验方法28-29
  • 3.3.1 EM-1 酯化多肽前药自组装NP的配制28
  • 3.3.2 自组装NP的理化表征28-29
  • 3.4 实验结果29-32
  • 3.4.1 EM-1 酯化多肽前药自组装NP的配制29-30
  • 3.4.2 自组装NP的理化表征30-32
  • 3.5 讨论与结论32-34
  • 3.5.1 实验讨论32-33
  • 3.5.2 实验结论33-34
  • 第四章 EM-1 酯化多肽前药自组装NP的脑内递药研究34-42
  • 4.1 设计思路34
  • 4.2 实验材料34
  • 4.2.1 实验动物34
  • 4.2.2 试剂及药品34
  • 4.2.3 仪器34
  • 4.3 实验方法34-36
  • 4.3.1 药效学研究34-35
  • 4.3.2 近红外活体动物荧光成像研究35
  • 4.3.3 统计学分析35-36
  • 4.4 实验结果36-40
  • 4.4.1 药效学研究36-37
  • 4.4.2 近红外活体动物荧光成像研究37-40
  • 4.5 讨论与结论40-42
  • 4.5.1 实验讨论40-41
  • 4.5.2 实验结论41-42
  • 第五章 EM-1 酯化多肽前药自组装NP的稳定性研究42-47
  • 5.1 设计思路42
  • 5.2 实验材料42-43
  • 5.2.1 试剂及药品42
  • 5.2.2 仪器42-43
  • 5.3 实验方法43-44
  • 5.3.1 EM-1、C_(18)-SS-EM1 NP、C_(18)-CONH-EM1 NP的离体酶解稳定性研究43
  • 5.3.2 C_(18)-SS-EM1 NP的DTT还原响应研究43-44
  • 5.3.3 统计学分析44
  • 5.4 实验结果44-46
  • 5.4.1 EM-1、C_(18)-CONH-EM1 NP、C_(18)-SS-EM1 NP的离体酶解稳定性研究44-45
  • 5.4.2 C_(18)-SS-EM1 NP的DTT还原响应研究45-46
  • 5.5 讨论与结论46-47
  • 5.5.1 实验讨论46
  • 5.5.2 实验结论46-47
  • 第六章 EM-1酯化多肽前药自组装NP(C_(18)-SS-EM1)的体内药动学研究47-58
  • 6.1 设计思路47
  • 6.2 实验材料47-48
  • 6.2.1 试剂及药品47
  • 6.2.2 仪器47-48
  • 6.3 实验方法48-50
  • 6.3.1 包载荧光探针Coumarin-6 的C_(18)-SS-EM1 NP体外泄漏研究48
  • 6.3.2 药动学研究48-50
  • 6.4 实验结果50-56
  • 6.4.1 包载荧光探针Coumarin-6 的C_(18)-SS-EM1 NP体外泄漏研究50-52
  • 6.4.2 药动学研究52-56
  • 6.5 讨论与结论56-58
  • 6.5.1 实验讨论56-57
  • 6.5.2 实验结论57-58
  • 论文总结与展望58-60
  • 参考文献60-65
  • 缩略词中英文对照表65-66
  • 在学期间的研究成果66-67
  • 致谢67-68
  • 附录68-83

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