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《兰州大学》 2017年
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重组促血小板生成素模拟肽-人血清白蛋白融合蛋白的分离纯化及稳定性研究

王娜  
【摘要】:重组人促血小板生成素(rhTPO)在临床上用于治疗血小板减少症时可产生中和性抗体,导致血小板进一步减少,在美国止步于临床试验阶段。本实验室前期利用重组DNA技术,将HSA和一段与TPO没有同源性的随机模拟肽短序列TMP二联体(dTMP)融合,并在CHO表达系统内高效表达了dTMP-HSA融合蛋白,成功克服了rhTPO的上述缺点,并有效延长了小分子dTMP的半衰期。本实验室利用WAVE反应器大规模表达生产了dTMP-HSA融合蛋白,为从WAVE反应器的培养上清中获得大量质量符合要求的dTMP-HSA融合蛋白,需要建立高效且经济的下游纯化工艺。本研究利用多种色谱层析技术,建立了针对CHO细胞表达的dTMP-HSA融合蛋白的纯化工艺,最终得到了纯度不低于93%的目的蛋白,总回收率为18%。对纯化后的目的蛋白进行了部分结构确证和质量研究,肽序列覆盖率大于97%,单体分子量71.50 kDa,等电点5.54,最大吸收峰为280nm±2nm,Western Blot结果显示dTMP-HSA融合蛋白针对抗HSA的抗体和抗dTMP的抗体均呈阳性反应,宿主DNA残余量每剂小于100pg,宿主蛋白残余量不高于总蛋白的0.05%。对dTMP-HSA融合蛋白的稳定性进行了初步研究,通过对pH和添加辅料的筛选,最终确定了相对稳定的储存条件。加速实验结果显示,目的蛋白在此条件下储存:4℃可存放694天,25℃可存放45天,为后续的制剂开发提供参考依据。
【关键词】:促血小板生成素模拟肽 人血清白蛋白 纯化 质量控制 稳定性
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R945
【目录】:
  • 缩略词6-7
  • 中文摘要7-8
  • Abstract8-10
  • 第一章 文献综述10-25
  • 1 血小板减少症及相关治疗药物研究进展10-14
  • 1.1 血小板减少症10-11
  • 1.2 治疗血小板减少症的相关药物11-14
  • 2 HSA融合技术研究概况14-18
  • 2.1 长效融合蛋白技术研究进展14-15
  • 2.2 HSA研究进展15-17
  • 2.3 HSA融合技术研究进展17-18
  • 3 重组蛋白药物的分离纯化技术研究进展18-24
  • 3.1 重组蛋白药物的分离纯化18-19
  • 3.2 色谱分离技术在重组蛋白药物纯化过程中的应用19-22
  • 3.3 重组蛋白药物纯化方法的合理选择22-24
  • 4 立题依据24-25
  • 第二章 dTMP-HSA融合蛋白的分离纯化工艺研究25-48
  • 1 引言25
  • 2 实验材料25-30
  • 2.1 试剂及配方25-30
  • 2.2 主要仪器设备30
  • 3 实验方法30-34
  • 3.1 dTMP-HSA融合蛋白的预处理及含量测定30-31
  • 3.2 从离子交换层析出发的纯化工艺探索31-32
  • 3.3 从疏水层析出发的纯化工艺探索32-34
  • 4 结果分析34-45
  • 4.1 连续四批dTMP-HSA融合蛋白表达量的测定34-35
  • 4.2 从离子交换层析出发的纯化工艺探索35-40
  • 4.3 从疏水层析出发的纯化工艺探索40-45
  • 5 讨论45-48
  • 第三章 dTMP-HSA融合蛋白的质量研究48-65
  • 1 引言48
  • 2 实验材料48-50
  • 2.1 试剂及配方48-50
  • 2.2 主要仪器设备50
  • 3 实验方法50-54
  • 3.1 物理化学检测50-51
  • 3.2 生物学检测51-53
  • 3.3 纯度和杂质检测53-54
  • 4 结果分析54-63
  • 4.1 物理化学检测结果54-58
  • 4.2 生物学检测结果58-61
  • 4.3 纯度和杂质检测结果61-63
  • 5 讨论63-65
  • 第四章 dTMP-HSA融合蛋白的稳定性研究65-74
  • 1 引言65
  • 2 材料与仪器65-66
  • 2.1 试剂及配方65-66
  • 2.2 主要仪器设备66
  • 3 实验方法66-67
  • 3.1 pH对dTMP-HSA融合蛋白储存稳定性的影响66
  • 3.2 辅料对dTMP-HSA融合蛋白储存稳定性的影响66-67
  • 3.3 恒温加速试验67
  • 4 结果与分析67-72
  • 4.1 pH对dTMP-HSA融合蛋白储存稳定性的影响67-68
  • 4.2 辅料对dTMP-HSA融合蛋白储存稳定性的影响68-70
  • 4.3 恒温加速试验70-72
  • 5 讨论72-74
  • 第五章 结论74-75
  • 参考文献75-84
  • 攻读硕士学位期间已发表的研究成果84-85
  • 致谢85

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