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《甘肃农业大学》 2017年
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中国H3N2(2009-2014年)和H5(2015-2016年)亚型禽流感病毒的生物学特性研究

关立峥  
【摘要】:H5亚型禽流感病毒随着其不断进化、变异及对宿主的适应,部分毒株已经稳定存在并获得对其自然宿主的高致病力,这不仅严重危害到养禽业的发展,更对人类的公共卫生安全构成潜在威胁。H3N2亚型流感病毒具有广泛的感染宿主谱,除了可以感染野鸟和家禽外,还可以感染猪、犬、猫、雪貂等多种哺乳动物,而且是造成人的季节性流感最直接的病原之一。近年来的禽流感监测数据显示,H3N2亚型禽流感病毒不仅是水禽中分离率最高的流感病毒亚型之一,而且在我国大多数地区流行,病毒分离数目有逐年增多的趋势。为了解我国H5和H3N2亚型禽流感病毒的流行趋势,评估病毒对哺乳动物感染和传播的潜在风险,本研究选取2015-2016年分离到的66株具有代表性的H5亚型禽流感病毒和2009-2014年分离到的26株具有代表性的H3N2亚型禽流感病毒进行了病毒的遗传演化分析、抗原性分析、受体结合特异性分析、对小鼠的感染性和致病性分析以及H3N2亚型禽流感病毒在豚鼠中的复制和传播能力的分析。66株病毒的HA和NA亚型组合共有5种,即H5N1、H5N2、H5N3、H5N6和H5N8,其中以H5N6亚型禽流感病毒为主。病毒的遗传演化分析表明,66株病毒可划分为A、B、C、D和E共5种基因型,其中H5N1亚型禽流感病毒包括A1-A3基因型,H5N6亚型禽流感病毒包括D1-D16基因型,表明我国流行的H5亚型禽流感病毒具有明显的遗传多样性,且内部基因存在与H1、H5、H7、H9、H12等多种野鸟源的禽流感病毒、H3和H6等多种低致病性禽流感病毒的内部基因存在广泛的基因重排现象,此外,还与人源分离株H5N6或H7N9以及猪源H3N2亚型流感病毒的内部基因有着较近的亲缘关系。H3N2亚型禽流感病毒的遗传演化分析结果表明,26株病毒的基因型各不相同,病毒的基因来源具有明显的遗传多样性。HA基因与马源、人源和猪源H3亚型流感病毒的亲缘关系较远,内部基因则与野鸟源的多种不同亚型的低致病性,如H1N2、H1N9、H2N3、H6N6和H10N5等禽流感病毒的内部基因具有广泛的基因重排现象。此外,还有一些进化相对古老的基因片段与高致病性H5N1或H5N2禽流感病毒甚至是猪源H4N8流感病毒的基因片段存在着密切的亲缘关系。病毒的抗原性分析结果表明,clade 2.3.4.4分支的大部分病毒与我国当前所使用的Re-8疫苗株的反应性良好,少数病毒与Re-8疫苗株的抗原性存在一定差异。此外,clade 2.3.2.1分支病毒与我国当前所使用的Re-6疫苗株的抗原性存在较大差异,抗原性差异明显。除此以外,当前我国流行的H3N2亚型禽流感病毒已发生明显的抗原性漂移,与人源、猪源H3N2亚型流感病毒的抗原性差异明显。小鼠的感染性和致病性实验结果表明,66株H5亚型禽流感病毒均能在小鼠的呼吸系统内复制,在除鼻甲和肺脏以外的脑、脾脏和肺脏中选择性复制。66株病毒对小鼠的致病力具有显著性差异,A基因型病毒对小鼠呈现中、高2种致病力,B和C基因型病毒对小鼠呈现中、低2种致病力,D基因型对小鼠呈现低、中、高3种致病力,E基因型病毒对小鼠呈现高致病力。大部分H3N2亚型禽流感病毒不需适应就能够在小鼠的呼吸系统内有效复制,小鼠感染病毒后均不表现出明显的临床症状,病毒对小鼠均不致死,表现出对小鼠的低致病力。对HA蛋白的受体结合位点及其周围有氨基酸变化的10株病毒(2株H5N1、1株H5N3、6株H5N6和1株H5N8亚型禽流感病毒)进行受体结合特异性的分析,研究结果表明病毒的受体结合特异性不尽相同。所有的病毒均具有极强的与α-2,3-SA受体结合的能力,但与α-2,6-SA受体结合的能力则表现为不结合、微弱、中等和较强4种形式。挑选的10株H3N2亚型禽流感病毒均同时具备与α-2,3-SA和α2,6-SA受体结合的能力,尽管病毒与前者的结合能力更强。挑选在小鼠上呼吸道高效复制且具有与人型受体结合能力的5株病毒检测其在豚鼠中的复制能力、直接接触传播和呼吸道飞沫传播能力。豚鼠的复制实验结果表明5株病毒均能在豚鼠的呼吸系统内复制,传播实验结果表明,5株病毒均能在豚鼠间进行高效的直接接触传播,此外有2株病毒能在豚鼠间进行中等能力的呼吸道飞沫传播,有1株病毒能在豚鼠间进行高效的呼吸道飞沫传播。综上所述,当前我国流行的H5亚型禽流感病毒亚型组合多样,基因来源复杂,部分病毒与当前所使用的疫苗株抗原差异明显,且具有感染人的潜在风险,而H3N2亚型禽流感病毒具有感染人并在人际间传播的潜在风险。
【关键词】:禽流感病毒 H5亚型 H3N2 生物学特性
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 摘要3-5
  • ABSTRACT5-8
  • 英文缩略表8-12
  • 第一章 文献综述12-40
  • 1 流感病毒的抗原性变异12-15
  • 1.1 抗原性变异相关基因的结构与功能12-14
  • 1.1.1 血凝素蛋白(HA)的结构与功能12-13
  • 1.1.2 神经氨酸酶蛋白(NA)的结构与功能13-14
  • 1.2 抗原变异的分子基础14-15
  • 1.2.1 抗原漂移14-15
  • 1.2.2 抗原转变15
  • 2 病毒的受体结合特异性15-17
  • 2.1 流感病毒的唾液酸受体15-17
  • 2.1.1 流感病毒的受体分布15-17
  • 3 与受体结合特异性相关的因素17-19
  • 3.1 HA蛋白的受体结合位点17-18
  • 3.2 受体结合位点对受体结合特异性的影响18-19
  • 4 受体结合特性对病毒传播能力的影响19-20
  • 5 影响病毒传播的主要因素20-23
  • 5.1 环境20
  • 5.2 宿主20-21
  • 5.3 病毒蛋白21-23
  • 5.3.1 HA蛋白21-22
  • 5.3.2 NA蛋白22
  • 5.3.3 内部基因蛋白22-23
  • 6 H5亚型流感病毒的流行病学概况23-33
  • 6.1 A/Goose/Guangdong/1/96 谱系H5亚型流感病毒的传播23-27
  • 6.2 H5亚型AIV的宿主分布27-33
  • 6.2.1 H5亚型AIV在野生水禽中的分布27-29
  • 6.2.2 H5亚型AIV在家禽中的分布情况29-30
  • 6.2.3 H5亚型AIV的跨物种传播30-33
  • 7 H3N2亚型流感病毒的宿主谱及流行概述33-37
  • 7.1 H3N2亚型流感病毒在人类中的流行34
  • 7.2 H3N2亚型流感病毒在猪群中的流行34-35
  • 7.3 H3N2亚型流感病毒在野鸟和家禽中的流行35-36
  • 7.4 H3N2亚型流感病毒在其他哺乳动物中的流行36-37
  • 8 本研究的目的和意义37-40
  • 第二章 2015-2016 年中国H5亚型禽流感病毒的生物学特性分析40-86
  • 1 材料与方法40-44
  • 1.1 实验动物40
  • 1.2 主要试剂40
  • 1.3 实验所用毒株40-41
  • 1.4 H5亚型AIVs的纯化及鸡胚半数感染量(EID50)的测定41
  • 1.5 H5亚型AIVs的半数致死量(MLD50)的测定41
  • 1.6 H5亚型AIVs的遗传演化分析41-43
  • 1.6.1 RT-PCR扩增41-42
  • 1.6.2 全基因组序列测定42-43
  • 1.6.3 遗传演化分析43
  • 1.7 H5亚型AIVs的抗原性分析43
  • 1.8 H5亚型AIVs对小鼠的感染性和致病性评价43
  • 1.9 H5亚型AIVs的受体结合特异性分析43-44
  • 1.9.1 H5亚型AIVs的浓缩与纯化43-44
  • 1.9.2 固相结合ELISA实验44
  • 2 结果44-80
  • 2.1 H5亚型AIVs的分布44-47
  • 2.2 H5亚型AIVs的遗传演化分析结果47-69
  • 2.2.1 HA基因的遗传演化分析47-50
  • 2.2.2 NA基因的遗传演化分析50-54
  • 2.2.3 PB2基因的遗传演化关系54-57
  • 2.2.4 PB1基因的遗传演化分析57-59
  • 2.2.5 PA基因的遗传演化分析59-61
  • 2.2.6 NP基因的遗传演化分析61-63
  • 2.2.7 M基因的遗传演化分析63-65
  • 2.2.8 NS基因的遗传演化分析65-67
  • 2.2.9 H5亚型AIVs基因型的划分67-69
  • 2.3 H5亚型AIVs的抗原性分析结果69-72
  • 2.4 H5亚型AIVs的受体结合特异性分析结果72-73
  • 2.5 H5亚型AIVs对小鼠的感染性和致病性结果73-80
  • 3 讨论80-86
  • 第三章 2009-2014 年中国H3N2亚型禽流感病毒的生物学特性分析86-121
  • 1 材料和方法86-89
  • 1.1 实验动物86
  • 1.2 试剂86-87
  • 1.3 实验用毒株87
  • 1.4 H3N2亚型AIVs的纯化及EID50测定87
  • 1.5 H3N2亚型AIVs的遗传演化分析87
  • 1.5.1 RT-PCR扩增87
  • 1.5.2 全基因组序列测定87
  • 1.5.3 H3N2亚型AIVs的遗传演化分析87
  • 1.6 H3N2亚型AIVs的抗原性分析87
  • 1.7 H3N2亚型AIVs对小鼠的感染性和致病性分析87
  • 1.8 H3N2亚型AIVs的受体结合特异性分析87
  • 1.8.1 蔗糖密度梯度离心浓缩纯化H3N2亚型AIVs87
  • 1.8.2 固相结合ELISA实验检测H3N2亚型AIVs的受体结合特异性87
  • 1.9 H3N2亚型AIVs在豚鼠中的复制和传播能力评估87-89
  • 1.9.1 H3N2亚型AIVs在豚鼠体内的复制能力评估87-88
  • 1.9.2 H3N2亚型AIVs在豚鼠间的接触传播能力评估88
  • 1.9.3 H3N2亚型AIVs在豚鼠间的呼吸道飞沫传播能力评估88-89
  • 2 结果89-116
  • 2.1 H3N2亚型AIVs的EID50测定结果89
  • 2.2 H3N2亚型AIVs的遗传演化分析结果89-105
  • 2.2.1 表面基因(HA和NA基因)的遗传演化关系90-95
  • 2.2.2 内部基因的遗传演化分析结果95-105
  • 2.3 H3N2亚型AIVs的抗原性分析结果105-108
  • 2.4 H3N2亚型AIVs对小鼠的感染性和致病性分析108-110
  • 2.5 H3N2亚型AIVs的受体结合特异性分析110-111
  • 2.6 H3N2亚型AIVs在豚鼠中的复制能力以及传播能力的评估111-116
  • 3 讨论116-121
  • 第四章 全文结论121-122
  • 参考文献122-140
  • 附录140-152
  • 致谢152-154
  • 作者简介154-156
  • 导师简介156-157

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