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《甘肃农业大学》 2017年
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自噬促进传染性法氏囊病病毒释放的作用机制研究

王永强  
【摘要】:传染性法氏囊病是一种感染雏鸡的免疫抑制性疾病,对世界范围的养禽业造成了巨大的经济损失。其病原传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)属于双RNA病毒科的禽双RNA病毒属。通过对病毒分子和细胞生物学、结构和致病机制等的不断研究,IBDV已成为该病毒科中的代表。因为对自噬在双RNA病毒感染中的调控及功能了解相对较少,IBDV就成为理解这一调控机制的重要模型。禽双RNA病毒的VP2可以在病毒感染的早期通过与受体复合物HSP90AA1的相互作用诱导AKT-mTOR的失活从而诱导自噬。但是,在IBDV感染的晚期,自噬流的诱导、调控及其与病毒相互作用的机制还需要进一步的研究。双RNA病毒家族的成员能够将病毒基因组整合成一个复合体结构,被称作“病毒工厂”,并定位于内体系统组份膜结构的胞质面。而且,高尔基体在IBDV组装过程中也发挥了重要的作用。但是病毒成熟与释放的机制需要深入地研究。最近有研究证明水痘病毒的细胞外排结合利用了内体系统和自噬路径。因此,在本论文的研究中,我们从宿主的角度出发尝试研究自噬在IBDV成熟与释放中的作用机制。在本研究中,我们利用IBDV研究自噬在禽双RNA病毒复制中的作用。研究证明IBDV在感染晚期诱导了LC3分子的荧光聚点、内源性LC3分子型别转换为LC3-II、超微结构典型的自噬体的显著增加,说明IBDV感染诱导了细胞自噬的发生。饥饿诱导细胞自噬使病毒蛋白pVP2和VP2的量显著增加,细胞内与细胞上清中的感染性子代病毒量也显著增加。WM抑制自噬,使细胞内与细胞上清中子代病毒的量显著降低;3-MA抑制自噬,使病毒蛋白pVP2和VP2均显著地减少,而且细胞内与细胞上清中子代病毒的量也显著降低。敲低LC3B有效抑制了自噬,使病毒蛋白pVP2显著减少,而且细胞内与细胞上清中子代病毒也都极显著地降低。敲低ATG5显著抑制了自噬,使病毒蛋白pVP2显著地减少,而且细胞内与细胞上清中子代病毒的量都显著降低。病毒感染后(p)VP2、VP3、dsRNA与LAMP1存在部分共定位。感染使LAMP1核心多肽和LAMP1糖基化的蛋白量均有显著的增加。BAF A1作用抑制了病毒诱导的自噬体与溶酶体的融合,从而使病毒蛋白pVP2和VP2的量均显著地降低,细胞内与细胞上清中子代病毒的量也显著降低。CQ作用抑制了病毒诱导的自噬溶酶体的降解,从而使病毒蛋白pVP2的量显著增加,而VP2的量却显著降低,细胞内与细胞上清中子代病毒的量也显著地降低。这证明了IBDV诱导了自噬体与溶酶体的融合,但并没有有效地降解其包裹的内容物,而病毒粒子利用自噬囊泡的低pH环境来促进病毒的成熟。利用免疫电镜观察发现大量的完整病毒粒子按晶格样排列并被自噬溶酶体标志分子p62包围并有部分渗透到病毒粒子间。电镜也观察到大量的完整病毒粒子被囊泡膜结构所包裹,介导明显的释放。说明自噬内体系统协助了病毒蛋白的成熟和膜介导的子代病毒粒子的释放。该研究证明了自噬增强病毒感染晚期的复制,自噬通路协助了IBDV复制复合体的功能与病毒组装,对于完成病毒生命周期是十分关键的。而且,病毒绑架了自噬囊泡,利用其酸性环境促进病毒的成熟,和一种膜介导的释放与细胞到细胞的再感染机制。这就提出了一种自噬内体系统介导IBDV成熟、释放与再感染的机制。
【关键词】:传染性法氏囊病病毒 自噬 复制 成熟 释放
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 摘要5-6
  • Abstract6-10
  • 第一章 绪论10-26
  • 1.1 IBD及IBDV研究进展10-17
  • 1.1.1 IBD概述10-11
  • 1.1.2 IBDV形态结构11
  • 1.1.3 IBDV基因组11-12
  • 1.1.4 IBDV蛋白功能12-15
  • 1.1.5 IBDV复制周期15-17
  • 1.2 细胞自噬的研究概况17-22
  • 1.2.1 细胞自噬17-18
  • 1.2.2 细胞自噬的发生过程18
  • 1.2.3 细胞自噬的调控18-20
  • 1.2.4 细胞自噬的功能20-22
  • 1.3 细胞自噬与病毒感染的相关研究22-25
  • 1.3.1 病毒抵抗自噬机制22-23
  • 1.3.2 病毒诱导自噬以促进病毒的复制23-25
  • 1.3.3 IBDV与细胞自噬25
  • 1.4 本研究的目的和意义25-26
  • 第二章 传染性法氏囊病病毒感染诱导细胞自噬26-32
  • 2.1 材料26
  • 2.1.1 主要试剂26
  • 2.1.2 病毒、细胞和质粒26
  • 2.2 方法26-28
  • 2.2.1 IBDV感染与TCID_(50)滴度测定26-27
  • 2.2.2 提取细胞线粒体27
  • 2.2.3 SDS-PAGE & Western blot27
  • 2.2.4 激光共聚焦观察27-28
  • 2.2.5 电镜观察28
  • 2.2.6 统计分析28
  • 2.3 实验结果分析28-31
  • 2.3.1 IBDV感染DF-1 细胞 36h诱导细胞凋亡28-29
  • 2.3.2 WB检测证明IBDV感染DF-1 细胞 24h诱导细胞自噬29
  • 2.3.3 共聚焦观察证明IBDV感染DF-1 细胞 24h诱导细胞自噬29
  • 2.3.4 电镜观察证明IBDV感染DF-1 细胞 24h诱导细胞自噬29-31
  • 2.4 讨论31-32
  • 第三章 自噬促进传染性法氏囊病病毒的成熟、释放与再感染32-50
  • 3.1 材料32
  • 3.1.1 主要试剂32
  • 3.1.2 病毒、细胞和质粒32
  • 3.2 方法32-36
  • 3.2.1 IBDV感染与TCID50滴度测定32
  • 3.2.2 引物的设计与合成32-33
  • 3.2.3 细胞总RNA的提取和cDNA的合成33
  • 3.2.4 常规PCR33
  • 3.2.5 真核表达载体的构建33
  • 3.2.6 siRNA & shRNA的转染33-34
  • 3.2.7 SDS PAGE & Western Blot34
  • 3.2.8 激光共聚焦观察34
  • 3.2.9 3D活细胞成像34-35
  • 3.2.10 高内涵分析35
  • 3.2.11 免疫电镜观察35-36
  • 3.2.12 统计分析36
  • 3.3 实验结果分析36-48
  • 3.3.1 诱导自噬促进IBDV的复制36
  • 3.3.2 抑制自噬降低IBDV的复制36-38
  • 3.3.3 敲低LC3B降低IBDV的复制38
  • 3.3.4 敲低ATG5降低IBDV的复制38-40
  • 3.3.5 IBDV感染诱导amphisome和/或autolysosome的形成40
  • 3.3.6 IBDV组装相关蛋白集聚在LysoTracker标记的酸性囊泡周围40-42
  • 3.3.7 IBDV组装相关基本元件与LAMP1共定位42-43
  • 3.3.8 阻断自噬体与溶酶体的融合降低IBDV的复制43
  • 3.3.9 抑制自噬溶酶体的酸化降低IBDV的复制43-45
  • 3.3.10 自噬囊泡促进IBDV的成熟、释放与再感染45-48
  • 3.4 讨论48-50
  • 第四章 全文结论50-51
  • 参考文献51-61
  • 致谢61-62
  • 作者简历62-63
  • 导师简介63

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