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《甘肃农业大学》 2017年
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两种RNA测序文库制备方法的构建及其应用

邱源  
【摘要】:【目的】疾病的预防与控制是确保人和动物健康的关键。病毒性传染病的记载已有数千年,严重危害人类和动物的生存与健康。分离和鉴定病毒以及确定病毒与疾病和宿主的关系是预防、诊断和治疗病毒性传染病的首要任务。下一代测序(NGS)技术以高通量、低成本和快速为主要特征,克服了传统技术方法的局限性并满足大规模测序任务的要求,是目前快速鉴定和发现未知病原体的最高效而准确的技术。RNA病毒的快速检测,对于诊断、治疗、控制和预防由RNA病毒引起人和动物的感染性疾病至关重要。近年来,下一代测序技术的发展,创新了RNA病毒检测方法。NGS可以通过一些随机模式揭示标本内大量的核酸序列(DNA或RNA),并可同时检测各种RNA病毒。这些RNA病毒基因组的检测,不仅广泛应用于感染性疾病的诊断,还广泛应用于新型病毒的鉴定和宿主与病毒关系的研究。在使用NGS技术进行测序之前,RNA必须被逆转录,由于临床标本中的病毒RNA数量有限、容易发生降解,因此制备有效的测序文库仍然是基于NGS技术检测RNA病毒基因组的关键,但其方法仍然复杂,需要进一步优化。为了更好地鉴定RNA病毒,本研究尝试设计一种操作简便、测序结果更为理想、花费更少的RNA病毒测序文库制备方法。为RNA病毒基因组下一代测序文库的构建方法提供数据和参考。【方法】首先是设计用于检测RNA病毒基因组的下一代测序文库制备方法。方法1是商业化试剂盒法,根据制造商的说明书进行的。简言之,定量提取的病毒RNA,然后使用RNase III消化。将片段化的RNA与随机接头连接,然后进行逆转录。通过PCR扩增c DNA,最后收集约450bp大小的文库扩增子。方法2是自行发明的,以随机RT反应开始,合成第一链后使用RNase H特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA,再合成第二链c DNA并进行PCR扩增,最后收集约450bp大小的文库扩增子。方法3是从一个序列非依赖性单引物扩增(SISPA)方法的基础上改进的。简言之,使用随机引物SPN8逆转录提取的病毒RNA,然后将RT体系变性。使用变性的RT体系修饰第二链c DNA合成后,使用引物SP进行PCR。将PCR扩增产物剪切,然后连接测序接头。最后,收集约450bp大小的连接产物并扩增。新方法设计成功后,使用三种方法分别对已知样品制备文库。所有文库均使用相同的测序试剂分别在Ion 318?芯片上,通过Ion Torrent PGM平台测序。将测序所得reads和contigs的数量和种类、测序深度及平均覆盖率等方面分析,比较三种方法的优缺点。最后采集临床样品,用三种方法分别建库测序来验证各个方法在病毒鉴定和特性分析等方面的特点。【结果】本论文主要研究内容和结果如下:(一)RNA病毒基因组下一代测序文库的构建使用三种方法分别制备RNA病毒基因组的下一代测序文库。其中,方法1中,测序引物通过随机杂交引入,并使用Ion Total RNA-Seq v2连接到片段化的病毒RNA。方法2是自行设计的,其原理是通过随机逆转录(RT)和聚合酶链反应(PCR)构建文库。另外,方法3使用单一引物通过杂交并连接到片段化的随机RT-PCR扩增,该方法是我们借助序列非依赖性单引物扩增(SISPA)法原理修饰改进的。本研究中,通过对采集的临床样品进行PCR检测,筛选其中含有特异性AIV,NDV和IBV的样品作为模拟样品同时建库测序来检验方法2和方法3的可行性,并对三种方法进行比较。实验过程发现,方法1中使用RNaseⅢ使RNA片段化的过程难以确定酶切时间,并且对文库质量难以控制。研究发现,三种方法均检测到AIV和NDV,而只有方法3可检测到IBV。方法2和3在被用于制备检测RNA病毒基因组的测序文库方面可能优于方法1。从测序深度和测序覆盖率分析表可以看出,方法2和方法3在测序深度和测序覆盖率方面优于方法1,其中在方法3比方法2在测序覆盖率上更有优势。(二)病毒宏基因组学分析鸭子粪便样本中的病毒本研究中,收集活禽市场鸭子的粪便样品制成的混合样品,采用三种RNA病毒基因组下一代测序文库制备方法分别建库测序并对结果进行分析比较。研究发现,方法2和3在被用于制备检测RNA病毒基因组的测序文库方面可能优于方法1。方法1在低RNA浓度样品情况下检测和鉴定RNA病毒没有优势。方法2和方法3可以检测到较多的病毒科和病毒属,而且方法2更有优势。另外,分析病毒时,为确保大多数hits是可靠的,我们手动检查了所有843个不包含噬菌体的病毒,发现所有病毒hits有30个例外的病毒hits。通过分析病毒宿主,我们发现鸭子生活环境和饮食中存在的一些病毒,为鸭子潜在疾病的预防、饮食卫生和环境的杀菌消毒等提供理论指导。(三)病毒宏基因组学分析水貂粪便样本中的病毒本研究中,从水貂养殖场收集水貂粪便样品制成的混合样品,采用三种RNA病毒基因组下一代测序文库制备方法分别建库测序并对结果进行分析比较。研究发现,方法2和方法3可以检测到较多的病毒科和病毒属,而且方法2获得最多的病毒contigs。手动检查了所有3534个不包含噬菌体的病毒,发现所有病毒hits有10个例外的病毒hits。水貂冠状病毒株WD1127和WD1133测序覆盖率分析,方法2和方法3均优于方法1,而且方法2测序WD1127毒株有优势、方法3测序WD1133毒株有优势。分析病毒宿主和来源,我们发现了一些重要的水貂病毒数据和多个病毒可能是通过本研究首次在水貂报道的,为水貂病毒的检测和预警提供理论参考。【结论】综上所述,本研究建立了可靠的RNA病毒基因组下一代测序文库制备方法,并且应用这些方法分别对含有已知病毒AIV、NDV、IBV的模拟样品中,新鲜采集的鸭子粪便和水貂粪便混合样品建库测序。通过上述研究,我们发现方法2和方法3比方法1可以获得更多的映射到病毒的contigs,而且可以鉴定更多的病毒科和病毒属。方法3在测序深度和覆盖率分析中似乎是最好的。因为方法1和方法3都需要用于核酸片段化和测序接头连接的特定商业化试剂盒,所以比不需要任何试剂盒的方法2费用更加昂贵。从操作难易程度上讲,方法2和方法3操作简便耗时较短,而且易于控制建库质量,其中方法2更具优势。这项研究对于选择合适的方法来制备用于RNA病毒的病毒检测的测序文库是重要的。它还产生了关于鸭和水貂的一些重要的病毒学数据,并且多种水貂病毒属可能是通过本研究首次报道。
【关键词】:下一代测序 文库 病毒基因组 RNA病毒 检测 水貂 鸭子
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65;Q78
【目录】:
  • 中文摘要7-9
  • Summary9-12
  • 中英文缩略词表12-13
  • 第一章 引言13-21
  • 1 研究背景13-14
  • 2 文献综述14-19
  • 2.1 新发感染病的概要14-15
  • 2.2 发现病毒的主要方法15-17
  • 2.2.1 病毒的分离培养15
  • 2.2.2 光学和电子显微镜技术15-16
  • 2.2.3 分子诊断技术16-17
  • 2.2.3.1 基于PCR的技术16
  • 2.2.3.2 下一代测序技术16-17
  • 2.3 病毒宏基因组学17-19
  • 3 研究目的和意义19-21
  • 第二章 病毒RNA基因组下一代测序文库方法的建立21-48
  • 1 背景21
  • 2 材料与方法21-39
  • 2.1 实验材料21-23
  • 2.1.1 实验样品21
  • 2.1.2 酶及主要试剂21-22
  • 2.1.3 主要仪器22
  • 2.1.4 主要溶液配制22-23
  • 2.2 实验方法23-39
  • 2.2.1 样品的采集和预处理23-25
  • 2.2.1.1 采集临床样品23
  • 2.2.1.2 临床样品预处理23
  • 2.2.1.3 病毒RNA的提取23
  • 2.2.1.4 测定RNA浓度23-25
  • 2.2.2 下一代测序文库的制备25-33
  • 2.2.2.1 使用方法1构建测序文库25-28
  • 2.2.2.2 使用方法2构建测序文库28-30
  • 2.2.2.3 使用方法3构建测序文库30-33
  • 2.2.3 使用Ion OneTouch? 仪器做微乳液PCR33-35
  • 2.2.4 使用Ion OneTouch? ES富集ISPs35-36
  • 2.2.5 质控非富集的Ion PGM?模板OT2400 ISPs36
  • 2.2.6 对实验文库进行下一代测序36-39
  • 2.2.7 测序数据分析39
  • 3 实验结果39-45
  • 3.1 RT-PCR鉴定采集样品中的病毒40-41
  • 3.2 RNase Ⅲ使RNA片段化酶切时间的确定41-43
  • 3.3 测得的reads和contigs数分析43
  • 3.4 鉴定样品中的病毒43-44
  • 3.5 测序深度44-45
  • 3.6 测序覆盖率45
  • 4 讨论45-47
  • 5 小结47-48
  • 第三章 病毒宏基因组学分析鸭子粪便样本中的病毒48-63
  • 1 背景48
  • 2 材料与方法48-50
  • 2.1 实验材料48-49
  • 2.1.1 实验样品48
  • 2.1.2 酶及主要试剂48
  • 2.1.3 主要仪器48
  • 2.1.4 主要溶液配制48-49
  • 2.2 实验方法49-50
  • 2.2.1 样品的采集和预处理49
  • 2.2.1.1 采集临床样品49
  • 2.2.1.2 临床样品预处理49
  • 2.2.1.3 病毒RNA的提取49
  • 2.2.2 下一代测序文库的构建49-50
  • 2.2.3 使用Ion OneTouch? 仪器做微乳液PCR50
  • 2.2.4 使用Ion OneTouch? ES富集50
  • 2.2.5 质控50
  • 2.2.6 对实验文库进行下一代测序50
  • 2.2.7 测序数据分析50
  • 3 实验结果50-61
  • 3.1 测得的reads和contigs数51
  • 3.2 鉴定样品中的病毒51-61
  • 4 讨论61-62
  • 5 小结62-63
  • 第四章 病毒宏基因组学分析水貂粪便样本中的病毒63-76
  • 1 背景63
  • 2 材料与方法63-64
  • 2.1 实验材料63
  • 2.1.1 实验样品63
  • 2.1.2 酶及主要试剂63
  • 2.1.3 主要仪器63
  • 2.1.4 主要溶液配制63
  • 2.2 实验方法63-64
  • 3 实验结果64-72
  • 3.1 测得的reads和contigs数64-65
  • 3.2 鉴定样品中的病毒65-72
  • 4 讨论72-75
  • 5 小结75-76
  • 全文小结76-77
  • 附录77-84
  • 附录 177-80
  • 附录 280-84
  • 参考文献84-91
  • 致谢91-92
  • 作者简介92-94
  • 导师简介94-95

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